融合蛋白的纯化.

1融合蛋白的纯化2以蛋白质的结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失或断裂。3一、蛋白质分离纯化的一般程序1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；这也就是蛋白质分离纯化的前处理工作。当然如果我们要分析分离的蛋白质存在于细胞的外分泌物中的时候，就无需对生物组织进行破碎处理了，只需要用适当的缓冲溶液将蛋白质抽提出来就行。2.用离心法将细胞的亚细胞颗粒（如核、线粒体、微粒体或核糖体）及细胞碎片与溶液分开。3.应用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来。4.进一步应用层析法或电泳法使各种蛋白质分开。5.在适当条件下使蛋白质结晶或制成冻干粉。45蛋白质分离纯化中的注意事项：1.首先要建立一个方便灵敏的分析方法。2.分离步骤要尽可能少3.尽量避免蛋白质在提纯过程中的变性：包括六个方面6尽量避免蛋白质在提纯过程中的变性▼要求分离流程相当快速，同时分离过程通常要保持在低温（4℃）条件下进行。▼尽量避免过度暴露于氧气中▼注意重金属离子对酶的失活作用▼避免一切过激因素（如过酸或过碱）对蛋白活性的影响▼提取液的浓度应维持在较高水平▲最后，还需要注意的是：有少数蛋白质需在高离子强度的极性介质中保持活性，因此还需要想提取液中加入KCl、NaCl、(NH4)2SO467蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法1、蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。82、等电点沉淀法蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。93、低温有机溶剂沉淀法由于有机溶剂自由移动的离子较少，具有较低的介电常数，所以会使溶液的介电常数减小，从而增强偶极离子之间的静电引力，进而使蛋白分子集聚沉淀。另一方面，有机溶剂如果是水溶性的话，本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水合层（争夺水分子），也促使蛋白质分子脱水而沉淀。10（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法1、透析与超滤透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。2、凝胶过滤法也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadexgel）和琼脂糖凝胶（agarosegel）。111213（三）根据蛋白质带电性质进行分离1、电泳法各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳。14原理聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(IsoelectricFocusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrierampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。15两性电解质载体(carrierampholytes)(1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。(2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。(3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。(4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。16172、离子交换层析法离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。18阴离子交换层析19（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法亲和层析法（affinitychromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。20亲和沉析法的原理亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。如抗原和抗体，蛋白质A与一些鼠亚类抗体之间，均具有专一的亲和力，在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，改变条件可将抗原抗体解离。当把可结合的一对分子的一方(称配体)结合在惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该载体，双方即结合为一整体。然后设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。2122亲和配体间是如何结合的是两个分子之间，其构形有如积木般的互补，会因为范德华力的关系，产生特异亲和力.23亲和沉析法的各项要素24亲和沉析法的各项要素1.良好的固相基质（SolidMatrix）,如:聚丙烯酰胺（polyacrylamide）、几丁质（chitin）、聚苯乙烯（polystyrene）等。本试验是用琼脂糖小珠（sepharose）。基质是构成固定相的骨架。必须具备性质：1)具有较好的物理化学稳定性。。2)能够和配体稳定的结合。3)基质的结构应是均匀的多孔网状结构。4)基质本身与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附，不影响配体与待分离物的结合。252.配体（Ligand）亲和层析是利用配体和待分离物质的亲和力而进行分离纯化的，所以选择合适的配体对于亲和层析的分离效果是非常重要的。理想的配体应具有以下一些性质：1)配体与待分离的物质有适当的亲和力2)配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，对其它组分没有非特异性吸附作用。263)配体要能够与基质稳定的共价结合4)配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以多次重复使用273.Ligand与固相基质间之的耦合反应Ligand与固相基质之间，须有功能基可提供键结合反应︰固相基质-X+Y-Ligand→固相基质-x-y-Ligand4.可分离的目标分子28亲和层析的洗脱亲和层析的另一个重要的步骤就是要选择合适的条件使待分离物质与配体分开而被洗脱出来。亲和层析的洗脱方法可以分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱。在洗脱时，选择一种和配体亲和力较强的物质加入洗脱液，这种物质与待分离物质竞争对配体的结合，在适当的条件下，如这种物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基本被这种物质占据，原来与配体结合的待分离物质被取代而脱离配体，从而被洗脱下来。特异性洗脱方法的优点是特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。29融合蛋白的纯化特点及其步骤GST融合蛋白：pGEX载体表达的外源蛋白与GST融合，因此可以通过谷胱甘肽（GSH）-琼脂糖亲和沉析进行纯化。GST是一类以谷胱甘肽（r-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸——GSH）作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST对底物的亲和力是亚豪摩尔级的，因此GSH固化于琼脂糖形成的亲和沉析树脂对GST及其融合蛋白的纯化效率很高。可以用含游离的GSH的缓冲液洗脱结合的GST融合蛋白。30融合蛋白的纯化步骤3132His融合蛋和蛋白的纯化蛋白质表面的一些氨基酸，例如组氨酸等能够与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用（螯合作用）。因此偶联了合适金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性的吸附那些含有组氨酸的蛋白和对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。利用这一原理，我们用通用性配基亲和层析法纯化6xHisfusionprotein。基质与6xHisfusionprotein间产生了共价键，结合力强但特异性差33线性梯度浓度咪唑洗脱目的蛋白属于竞争性洗脱。梯度降低pH，通过减弱蛋白与金属离子的作用力洗脱蛋白。两者的作用原理是不同的。