谷氨酸发酵

1）生物素营养缺陷型作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Glu向膜外泄漏.控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10g/L).在发酵初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换.2）油酸营养缺陷型作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右.控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换.（3）添加表面活性剂添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18),也能造成细胞渗漏,积累谷氨酸.机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细胞膜.关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在下进行分裂,形成产酸型细胞.（4）添加青霉素机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作用下受损,向外泄露谷氨酸.控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换.谷氨酸发酵强制控制工艺为了稳产,克服培养基原料中某些成分不易控制带来的影响,在谷氨酸发酵时可采取“强制控制”的方法,如:“高生物素高吐温”或“高生物素高青霉素”的方法.控制方法:在发酵培养基中预先配加一定量(过量)的纯生物素,大大地削弱每批原料中生物素含量变化的影响,高生物素、大接种量能促进菌体迅速增殖.再在菌体倍增的早期加入相对高的吐温或青霉素,形成产酸型细胞.固定其它条件,确保高产稳产。谷氨酸发酵1.适应期:尿素分解出氨使pH上升.糖不利用.2-4h.措施:接种量和发酵条件控制使适应期缩短.2.对数生长期:糖耗快,尿素大量分解使pH上升,氨被利用pH又迅速下降.溶氧急剧下降后维持在一定水平.菌体浓度迅速增大,菌体形态为排列整齐的八字形.不产酸.12h.措施:及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH,在pH7.5-8.0时流加尿素;维持温度30-32℃3.菌体生长停止期:谷氨酸合成.措施:提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4.大量通**,控制温度34-37℃.4.发酵后期:菌体衰老,糖耗慢,残糖低.措施:营养物耗尽酸浓度不增加时,及时放罐.发酵周期一般为30h.二、谷氨酸发酵的生化过程（1）是代谢控制发酵的典型代表（2）是目前代谢控制发酵中，在理论与实践上最成熟的……整个过程可简单的分为2个阶段:第1阶段是菌体生长阶段;第2阶段是产酸阶段,谷氨酸得以大量积累。三、合成谷氨酸的生化途径（一）、GA的生物合成途径主要有：Glucose的酵解，EMPGlucose的有氧氧化，HMP丙酮酸的有氧氧化，TCA循环乙醛酸循环途径，DCA循环CO2固定反应α-酮戊二酸（α-KGA）的还原氨基化这6条途径之间是相互联系和相互制约的，如图所示：（二）、GA生物合成的内在因素从上图可以看出，菌体要在葡萄糖含量10%以上的培养基上，合成5%以上的谷氨酸，是一种不正常的现象，显然GA产生菌必须具备以下条件：谷氨酸生产菌的生化特征—内在因素1生物素缺陷型谷氨酸产生菌大多数为生物素缺陷型,谷氨酸发酵时,通过控制生物素亚适量(贫乏量),引起菌种代谢失调,使谷氨酸得到大量积累。2具有CO2固定反应的酶系菌种能利用CO2产生大量草酰乙酸,有利于谷氨酸的大量积累。3.α-KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失这是菌体生成并积累α-KGA的关键，从上图可以看出，α-KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，很快在α-KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由α-KGA进行还原氨基化生成GA的可能性很少。只有当体内α-KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，α-KGA才得以积累，为谷氨酸的生成奠定物质基础。4.GA产生菌体内的NADPH氧化能力欠缺或丧失1）如上图所示，NADPH是α-KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联的。（2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制α-KGA的脱羧氧化有一定的意义。5.产生菌体内乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA循环的封闭是实现GA发酵的首要条件。糖的代谢才能沿着α-酮戊二酸的方向进行,从而有利于谷氨酸的积累。6.菌体有强烈的L-谷氨酸脱氢酶活性α-KGA+NH4++NADPH==GA+NADP(NADH:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NADPH:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)L-谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌体内该酶的酶活性都很强，α-酮戊二酸易生成谷氨酸。该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联，反应机制如下：偶联反应α-KGANADPHα-KGAGANADP异柠檬酸CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。提高GA的潜力1）强化CO2固定反应，具体措施：Mn+，生物素.（2）控制溶氧浓度是非常重要的低的溶氧浓度，则丙酮酸向乳酸方向转化……高的溶氧浓度，则NADPH有被氧化的可能，……（五）GA发酵的外在因素GA发酵是一个典型的代谢控制发酵，固然有其内在的菌体特性。但是正如任何事物发展的基本规律一样，外在因素仍然有重要的作用，对于GA的发酵也是一样。1.供氧浓度过量：NADPH的再氧化能力会加强，使α-KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA的生成。供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。2.NH4+浓度（1）影响到发酵液的pH值（2）与产物的形成有关：NH4+过量，菌体增殖阶段会抑制菌体生长，产酸阶段Glu会受谷氨酰胺合成酶作用转化为谷氨酰胺（Gln）NH4+不足，不利于α-KGA的还原氨基化，-酮戊二酸积累，引起反馈调节NH4+与产物的形成3.磷酸盐过量：（1）促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等……（2）产生并积累缬氨酸（Val）环境条件4.发酵液的碳氮比发酵液中糖含量与谷氨酸的发酵有密切的关系。在一定范围内,谷氨酸的产量随糖含量的增加而增加,但糖含量过高,渗透压过大,对菌体生长不利,谷氨酸对糖的转化率低。发酵液中还原糖的含量一般应控制在10%～13%。环境条件氮源是合成菌体细胞蛋白质、核酸和谷氨酸的氨基来源，大约85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于合成菌体。谷氨酸发酵需要的氮源比一般发酵工业多得多，一般发酵工业碳氮比为100：0.2-2.0，谷氨酸发酵的碳氮比为100：15-21。在谷氨酸发酵过程中,应正确控制碳氮比。一般在菌体生长期碳氮比应大一些(氮低）,在产酸期,碳氮比应小些(氮高）。在碳源和氮源的比为3∶1时，谷氨酸棒状杆菌会大量合成谷氨酸，但当碳源和氮源的比为4∶1时，谷氨酸棒状杆菌只生长而不合成谷氨酸。环境条件5.生物素谷氨酸产生菌是营养缺陷型,对生长繁殖、代谢产物的影响非常明显。当生物素过量时酵解途径中的丙酮酸转变为乳酸,同时也使异柠檬酸转变为琥珀酸,菌体生长繁殖快,同时生物素又促进菌体细胞膜通透性障碍物的生物合成,使菌体不能及时将细胞内的谷氨酸排出,谷氨酸合成途径受阻,发酵液中由菌种细胞排出的谷氨酸仅能占氨基酸总量的12%;生物素亚适量时,菌体代谢失调,细胞膜通透性增强,细胞内的谷氨酸能及时排出,有利于谷氨酸的积累,发酵液内由菌体细胞排除谷氨酸能达总氨基酸的92%左右。因此,要根据发酵时期来控制生物素的含量。环境条件6.发酵温度谷氨酸发酵前期应采取菌体生长最适温度,即30～32℃。温度过低,菌体生长繁殖慢;若温度过高,菌体易衰老,生产中表现为DO值增长慢,耗糖慢,pH值高,最终发酵周期长,产酸少。发酵中、后期菌体生长基本停止,为积累大量谷氨酸,应适当提高发酵温度,但温度过高,酶易失活,谷氨酸生成受阻。环境条件7.pH值1）pH值对谷氨酸产生菌生长的影响谷氨酸产生菌象其它微生物一样,有最适生长pH值范围,当高于或低于这个值时:(1)菌体内的酶受到抑制,菌体新陈代谢受阻,生长停滞;(2)菌体细胞膜所带电荷发生改变,从而改变细胞膜的渗透性,影响菌体对营养的吸收和代谢产物的排出;(3)影响培养基组分和中间代谢产物的离解,从而影响菌体对这些物质的利用。环境条件2）pH值对谷氨酸积累的影响谷氨酸脱氢酶是合成谷氨酸的主要酶,它的最适pH为7.0～7.2,当发酵液的pH值偏酸时(pH5.0-5.8),谷氨酸脱氢酶受到抑制,代谢向着生成谷氨酰胺和乙酰谷氨酰胺的方向进行。在发酵后期由于耗用大量NH4+,pH值下降,此时就要进行pH值调节,以保证发酵的正常进行。环境条件pH发生变化的主要原因是培养基中营养成分的利用和代谢产物的积累。如当谷氨酸棒状杆菌利用糖类物质不断生成谷氨酸时，培养液的pH就会下降。而碱性物质的消耗和氨的生成等则会导致培养液的pH上升。pH：前期pH（7.5-8.0），中后期pH7.0-7.6。通过采用流加尿素，氨水或液氨等办法调节pH，补充氮源。环境条件8.通风（同1.供氧浓度）通风的实质就是供氧并使菌体和培养基充分混合。谷氨酸产生菌为兼性好氧菌,在有氧、无氧的条件下都能生长,只是其代谢产物不同。在谷氨酸发酵过程中,通风必须适度。风量过大,氧气充足,在长菌阶段表现为耗糖慢,菌体生长慢,pH值偏高,产酸阶段,供氢体被氧化,谷氨酸合成受阻,积累α-酮戊二酸;风量小,供氧不足,长菌阶段表现为菌体生长快,在产酸阶段,葡萄糖进入菌体后,进行不完全氧化,产物由谷氨酸变为乳酸。环境条件9.泡沫谷氨酸发酵是好气性发酵,因通风和搅拌产生泡沫是正常的,但泡沫过多会带来一系列问题:(1)泡沫形成泡盖时,代谢产生的气体不能及时排出,妨碍菌体呼吸作用,影响菌体的正常代谢;(2)泡沫过多,发酵液会外溢,造成浪费和污染;(3)泡沫过多,易冲上罐顶,造成染菌。因此,在谷氨酸的发酵过程中控制好过多的泡沫是发酵成败的关键。谷氨酸产生菌的发酵条件与产物的关系谷氨酸发酵过程中,生产菌种的特性、生长素、发酵温度、pH值、通风和发酵产生的泡沫都是影响谷氨酸积累的主要因素。在实际生产中,只有针对存在的问题,严格控制工艺条件,才能达到稳产、高产的目的。假设人们想利用葡萄糖、谷氨酸棒状杆菌生产α-酮戊二酸，请你利用现有知识，如何设计一个大量积累α-酮戊二酸的方案?菌种：对谷氨酸捧状杆菌进行诱变处理，选育不能合成谷氨酸脱氢酶的菌种条件：氧（通风）、NH4+、C/N；pH、磷酸盐、温度、生物素、Mn+代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用(一)遗传学方法2抗反馈控制突变株的应用3选育组成型突变株和超产突变株（二）生物化学方法（三）控制细胞膜渗透性（三）控制细胞膜渗透性四、谷氨酸发酵1）谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、黄色短杆菌。我国使用的生产菌株是北京棒杆菌AS1.299、北京棒杆菌D110、钝齿棒杆菌AS1.542、棒杆菌S-914和黄色短杆菌T6-13等。生产菌株特点在己报道的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外，虽然它们在分类学上属于不同的属种，但都有一些共同特点:革兰氏阳性菌体为球形、短杆至棒状不形成芽孢没有鞭毛，不能运动需要生物素作为生长因子在通气条件下才能产生谷氨酸。2）生产原料发酵生产谷氨酸的原料有淀粉质原料：玉米、小麦、甘薯、大米等。其中甘薯和淀粉最为常用；大米进行浸泡磨浆，再调成15Bx，调pH6.0，加细菌a-淀粉酶进行液化，85℃30min，加糖化酶60℃糖化2