血清AFPGP73和GPC3联合检测

血清ＡＦＰ、ＧＰ７３和ＧＰＣ３联合检测在原发性肝癌诊断中的应用范公忍，王伟芳，韩聚强，姜胜莹，曹建彪（北京军区总医院全军肝病治疗中心，北京１００７００）摘要：目的探讨甲胎蛋白（ＡＦＰ）、高尔基体蛋白７３（ＧＰ７３）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖３（ＧＰＣ３）联合检测在原发性肝癌（ＰＨＣ）诊断中的临床应用价值。方法采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测１４８例ＰＨＣ患者、７３例肝硬化（ＬＣ）患者、５７例慢性乙型肝炎（ＣＨＢ）患者及８５名健康人（正常对照组）血清ＧＰ７３、ＧＰＣ３含量，同时采用免疫化学发光法检测血清ＡＦＰ含量，并对检测结果进行比较。结果ＰＨＣ组ＧＰ７３、ＧＰＣ３、ＡＦＰ血清水平分别为３４６．９±２０８．７、１４３．１±６６．９和（６９０．３±４０２．５）μｇ／Ｌ，与ＬＣ组、ＣＨＢ组和正常对照组血清水平比较差异具有统计学意义（Ｐ均＜０．０１）；血清ＡＦＰ、ＧＰ７３、ＧＰＣ３联合检测诊断ＰＨＣ的敏感性为９５．９％，准确性为８９．２％。结论血清ＡＦＰ、ＧＰ７３、ＧＰＣ３联合应用能弥补单项肿瘤标志物临床应用的不足，对提高ＰＨＣ的阳性检出率及鉴别诊断具有重要的临床意义。关键词：甲胎蛋白；高尔基体蛋白７３；磷脂酰肌醇蛋白聚糖３；联合检测；原发性肝癌原发性肝癌（ｐｒｉｍａｒｙｈｅｐａｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＰＨＣ）是临床常见的恶性肿瘤之一，病死率在消化系统恶性肿瘤中位居第３位，在全球发病率位居第５位，近年来在我国发病率呈逐年上升的趋势。由于临床上ＰＨＣ确诊时多属中晚期，术后容易复发及远处转移，预后较差，因此早期诊断ＰＨＣ是延长ＰＨＣ患者生存期的关键环节。血清甲胎蛋白（ａｌｐｈａｆａｔｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＦＰ）是目前临床上最常用的肿瘤标志物，但仍有２０％～３０％的ＰＨＣ患者ＡＦＰ呈阴性或低浓度水平，还有部分慢性肝病患者ＡＦＰ升高，但为非恶性肿瘤［２］。因此迫切需要寻找敏感性、特异性更高的肿瘤标志物和检测方法来提高ＰＨＣ的诊断水平。近年来研究证实，高尔基体蛋白７３（Ｇｏｌｇｉｐｒｏｔｅｉｎ７３，ＧＰ７３）和磷脂酰肌醇蛋白聚糖３（ｇｌｙｐｉｃａｎ３，ＧＰＣ３）与ＰＨＣ的发生、发展及预后关系密切，可用于ＰＨＣ患者的早期诊断，被认为是２种具有潜在价值的肿瘤标志物［３］。现有文献报道ＧＰ７３在ＰＨＣ临床血清诊断中是一个非常有价值的指标，其诊断ＰＨＣ的敏感性和特异性均高于ＡＦＰ，但关于ＧＰ７３在各种肝脏疾病中的临床意义各家报道不一［４］。因此有必要对ＧＰ７３的临床意义作深入细致的探讨。为了解ＧＰ７３和ＧＰＣ３在临床上应用的价值，本研究采用酶联免疫吸附试验（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）对１４８例ＰＨＣ患者分别检测血清中ＧＰ７３和ＧＰＣ３水平，并与ＡＦＰ检测结果进行了比较。材料和方法一、研究对象选择２０１１年１月至２０１３年６月北京军区总医院全军肝病治疗中心住院的ＰＨＣ患者１４８例作为研究对象，男８７例，女６１例，年龄４５～６９岁，入组患者均经超声或计算机断层扫描等影像学检查证实肝脏有实性占位性病变，伴或不伴ＡＦＰ阳性，同时经肝组织活检病理检查确诊，肝功能Ａ级或Ｂ级，诊断符合卫生部“原发性肝癌诊断规范（２０１１年版）”诊断标准［５］。肝硬化（ｌｉｖｅｒｃｉｒｒｈｏｓｉｓ，ＬＣ）患者７３例，男５２例，女２１例，年龄５２～７９岁；慢性乙型肝炎（ｃｈｒｏｎｉｃｈｅｐａｔｉｔｉｓＢ，ＣＨＢ）患者５７例，男３３例，女２４例，年龄４７～７６岁，诊断符合２０１０年中华医学会肝病学分会、感染学分会“病毒性肝炎防治指南”中病毒性肝炎诊断标准。另选择８５名健康人作为正常对照组，男５６名，女２９名，年龄４３～６８岁，经检测各型肝炎病毒标志物及ＡＦＰ均为阴性，无心、肝、肺、肾功能异常。对４组研究对象年龄、性别等进行比较，差异均无统计学意义（Ｐ均＞０．０５）。二、试剂与方法血清ＧＰ７３检测采用ＥＬＩＳＡ，试剂盒由北京热景生物技术有限公司提供，参考值≥１５０μｇ／Ｌ为ＰＨＣ阳性［６］；血清ＧＰＣ３ＥＬＩＳＡ试剂购自美国ＧｕｓａｂｉｏＢｉｏｔｅｃｈ公司，参考值≥９．５μｇ／Ｌ为ＰＨＣ阳性，ＥＬＩＳＡ仪为美国伯乐５５０型酶联仪。血清ＡＦＰ检测使用美国雅培ＡＸＳＹＭ免疫化学发光分析仪及同型配套试剂，参考值≥１２０μｇ／Ｌ为ＰＨＣ阳性。受检者在入院后均清晨空腹采集静脉血３ｍＬ，不抗凝，５００×ｇ离心５ｍｉｎ，留取血清转移至另一清洁的ＥＰ管内，放置－８０℃冰箱内低温保存，统一检测。三、统计学方法采用ＳＰＳＳ１９．０统计软件进行数据分析。计量数据用珋ｘ±ｓ表示，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用ｑ检验；计数资料用百分率表示，组间比较采用χ２检验。以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。结果一、血清ＧＰ７３、ＧＰＣ３和ＡＦＰ检测结果ＰＨＣ组患者血清ＧＰ７３、ＧＰＣ３和ＡＦＰ水平及阳性率明显高于其他３组，差异有统计学意义（Ｐ均＜０．０１）；４组间进行两两比较，ＰＨＣ组患者血清ＧＰ７３、ＧＰＣ３和ＡＦＰ水平明显高于ＬＣ组和ＣＨＢ组（Ｐ均＜０．０１）；ＬＣ组和ＣＨＢ组均高于正常对照组（Ｐ均＜０．０５）。见表１。二、３项指标诊断ＰＨＣ的受试者工作特征（ｒｅｃｅｉｖｅｒｏｐｅｒａｔｉｎｇｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ，ＲＯＣ）曲线分析ＧＰ７３、ＧＰＣ３和ＡＦＰ的曲线下面积分别为０．９５１、０．９８３和０．８６０，见图１。当截断值取１５０μｇ／Ｌ时，ＧＰ７３诊断ＰＨＣ的敏感性和特异性分别为８３．１％（１２３／１４８）和８６．９％（１１３／１３０）；当截断值取９．５μｇ／Ｌ时，ＧＰＣ３诊断ＰＨＣ的敏感性和特异性分别为７９．７％（１１８／１４８）和９１．５％（１１９／１３０）；当截断值取１２０μｇ／Ｌ时，ＡＦＰ诊断ＰＨＣ的敏感性和特异性分别为７６．４％（１１３／１４８）和８３．８％（１０９／１３０）；３项指标联合检测诊断ＰＨＣ的敏感性为９５．９％，特异性为８１．５％，联合检测诊断ＰＨＣ的效能显著高于ＡＦＰ单项检测（Ｐ＜０．０５）。见表２。讨论目前对ＰＨＣ的诊断依然依据病理及影像学诊断技术，但仅靠影像学检查对肝内的良恶性病变鉴别很困难，尤其是肝癌与肝炎后肝硬化造成的结节性改变不易鉴别。我国的ＰＨＣ患者绝大多数基于长期慢性肝炎、肝硬化患者，在这些高危人群中早期发现ＰＨＣ并及时治疗可明显提高５年生存率［７］。血清肿瘤标志物可以在影像学发现ＰＨＣ之前异常表达，对恶性肿瘤的发现起到监测和预警作用。因此，探讨ＡＦＰ联合多种肿瘤标志物检测提高ＰＨＣ检出率非常必要。ＧＰ７３是存在于高尔基体上的一种Ⅱ型跨膜糖基化修饰蛋白，含４００个氨基酸，在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｐｏｌｙａｏｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＳＤＳＰＡＧＥ）中显示其相对分子质量为７．３×１０４。近期的研究发现在ＰＨＣ患者的胆管上皮细胞中ＧＰ７３呈高水平表达，参与细胞黏附及信号传导，影响蛋白质的分泌和稳定性，参与机体的免疫调节及炎症反应［８］。Ｍａｒｒｅｒｏ等［９］研究发现在肝癌患者血清中，ＧＰ７３水平显著升高，而在正常人肝细胞中表达很少，甚至不表达。近一步的研究发现，其在ＰＨＣ患者中表达明显上调，与乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性ＬＣ及自身免疫学性肝炎引起的肝损伤有明显差异［１０１１］，对于ＰＨＣ患者的早期诊断及鉴别诊断具有重要临床意义。本研究结果显示，ＧＰ７３在ＰＨＣ患者血清中显著升高，ＰＨＣ组与ＬＣ、ＣＨＢ及正常对照组比较，差异有统计学意义（Ｐ均＜０．０１），证实血清ＧＰ７３对ＰＨＣ的诊断是一个较好的检测指标。这主要是因为ＰＨＣ时，大量ＧＰ７３由肝癌细胞或胆管上皮细胞合成并分泌到血液中，从而促使血清中ＧＰ７３水平显著升高。本研究中ＬＣ和ＣＨＢ患者ＧＰ７３亦有升高，但明显低于ＰＨＣ组，且阳性检出率很低，显示出ＧＰ７３可作为ＰＨＣ敏感的诊断标志物，此结果与国内外文献报道相一致［１２１４］。杨颖等［１５］研究显示在ＰＨＣ和ＬＣ的诊断中，血清ＧＰ７３检测与ＡＦＰ的诊断效能相似，ＬＣ患者的ＧＰ７３表达水平明显高于无ＬＣ的患者，小肝癌（≤３ｃｍ）患者ＧＰ７３水平高于大肝癌（≥６ｃｍ）患者，差异具有统计学意义（Ｐ均＜０．０１）。结果似乎显示出ＧＰ７３检测具有对ＰＨＣ早期诊断的价值。Ｔｉａｎ等［１６］研究发现ＧＰ７３与ＡＦＰ联合可作为肝脏疾病的检测指标，尤其可以提高ＡＦＰ阴性ＰＨＣ患者的检出率，并能为慢性肝损伤及ＬＣ的鉴别诊断提供依据。本研究结果发现ＧＰ７３诊断ＰＨＣ的效能与ＡＦＰ是否升高并无明显关系，ＡＦＰ阴性的ＰＨＣ患者，血清ＧＰ７３亦可以升高；ＬＣ和ＣＨＢ患者由于存在肝细胞的损伤，血清ＧＰ７３水平一度处于低水平表达并与ＰＨＣ表达常有较多重叠，但无诊断价值。因此，ＧＰ７３检测可以帮助诊断ＡＦＰ阴性的ＰＨＣ；同时对于ＣＨＢ、ＬＣ患者与ＰＨＣ的鉴别诊断可提供参考。ＧＰＣ３属于膜性硫酸乙酰肝素类糖蛋白超家族成员，是由蛋白质、脂类和糖三者共价连接的复杂糖复合物，其氨基端（Ｎ）为可溶性蛋白，在肝癌细胞中表达时可分泌至外周血液中［１７］，这是外周循环血液中能够检测到ＧＰＣ３的分子生物学基础。临床基础研究显示，肝细胞发生癌变时ＧＰＣ３可异常表达，激活的ＧＰＣ３可通过多种信号传导通路促进肝细胞恶性转化，增强其侵袭转移能力［１８１９］。研究者可利用血清学方法检测肝癌高危人群血清中ＧＰＣ３表达水平的变化，探索ＧＰＣ３表达与肝癌发生、发展及临床预后的相关性，从而为ＰＨＣ的诊断及预后判断提供帮助。本研究采用ＥＬＩＳＡ分别检测了ＰＨＣ、ＬＣ和ＣＨＢ患者及正常人群血清中ＧＰＣ３表达水平，结果显示ＰＨＣ组血清ＧＰＣ３呈高表达，而在ＬＣ、ＣＨＢ及正常对照组呈低表达，甚至无表达。江枫等［２０］应用ＥＬＩＳＡ检测发现ＰＨＣ患者血清ＧＰＣ３浓度高于肝炎后ＬＣ、ＣＨＢ患者及健康对照组（Ｐ均＜０．０１）；诊断ＰＨＣ的敏感性和特异性分别为８５．４％和９８．９％；进一步的研究发现，ＧＰＣ３能显著提高小肝癌与肝硬化结节的鉴别诊断。Ｙａｏ等［２１］研究发现ＰＨＣ患者血清中ＣＰＣ３分布量与ＡＦＰ不具有相关性。最近有研究报道，ＧＰ７３与ＡＦＰ检测对ＰＨＣ的诊断具有较好的一致性，且在诊断小肝癌方面ＧＰ７３优于ＡＦＰ，但ＣＰＣ３检测对ＰＨＣ诊断无意义（ＲＯＣ曲线下面积为０．４３）［２２］。本研究显示ＧＰＣ３与ＧＰ７３和ＡＦＰ相比在ＰＨＣ患者血清中表达水平较低，但与ＬＣ和ＣＨＢ患者血清中表达水平相比差异仍具有统计学意义（Ｐ均＜０．０１），同时发现在ＡＦＰ低水平表达的ＰＨＣ患者血清中ＧＰＣ３表达水平也比较高。本研究结论与Ｗａｎｇ等［２２］的报道不一致，分析原因可能与入选病例资料及检测试剂的来源不同有关。因此，对于ＧＰＣ３在ＰＨＣ患者的表达特征及其临床价值尚需大样本、多中心的实验数据进行深入研究。近年来的研究表明，多种肿瘤标志物与ＡＦＰ联合检测可相互弥补单一检测的不足，从而提高ＰＨＣ的诊断效能。有研究将ＡＦＰＬ与ＧＰ７３和ＧＰＣ３联合可明显提高ＰＨＣ的检出率，对ＰＨＣ的早期诊断具有重要的临床意义［２３］。本研究探讨了ＧＰ７３、ＧＰＣ３与ＡＦＰ联合检测对ＰＨＣ的诊断价值，３项联合检测对ＰＨＣ诊断的敏感性为９５．９％，明显高于ＡＦＰ单项检测的７６．４％（Ｐ＜０．０１）；同时３项联合检测准确性为８９．２％，而特异性仍可维持在较高水平。结果提示ＧＰ７３单项检测用于ＰＨＣ的诊断优势可能并不十分明显，而与ＡＦＰ等３项指标联合检测可明显提高ＰＨＣ的诊断效率，特别是对于无临床症状或体征及ＡＦＰ阴性ＰＨＣ患者的诊断具有较高的临床价值［２４］。本研究结果表明ＧＰ７３、ＧＰＣ３联合ＡＦＰ检测可明显提高ＰＨＣ的诊断率，具有较好的临床应用价值。参考文献［１］ＢｒｕｉｘＪ，ＳｈｅｒｍａｎＭ，ＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅＳｔｕｄｙｏｆＬｉｖｅｒＤｉｓｅａｓｅｓ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａｎｕｐｄａｔｅ［Ｊ］．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１１，５３（３）：１０２０１０２２．［２］武永乐，李冰，刘晖，等．ＧＰＣ３对