血药法测定小鼠口服给药阿司匹林的动力学参数

实验名称：血药法测定小鼠口服给药阿司匹林的动力学参数实验目的：掌握阿司匹林血样的处理方法掌握血药浓度-时间曲线的测定方法掌握血药法测定药物制剂动力学参数的方法。了解并学习常用作图软件，药代动力学参数计算软件（DAS软件）。实验试剂与仪器：昆明种小鼠80只，雌雄各半。阿司匹林泡腾片，眼科剪，眼科弯头镊，1.5mlEP管，5mlEP管，小鼠灌胃针，低温高速离心机（12000转），水杨酸标准品，阿司匹林标准品、蒸馏水，涡旋仪，乙腈，冰醋酸，双蒸水实验内容与步骤：动物分组：80只动物随机分为3组（1）单独给予阿司匹林200mg/kg26只（2）灌胃给予西咪替丁（CYP3A4抑制剂）50mg/kg，45min后灌胃给予阿司匹林200mg/kg26只（3）灌胃给予西咪替丁（CYP3A4抑制剂）100mg/kg，45min后灌胃给予阿司匹林200mg/kg28只1.小鼠的口服给药，摘眼球法采集血样小鼠灌胃给予阿司匹林200mg/kg，分别于给药前和给药后10min、30min、1h、2h、4h、8h、16h不同时间点摘眼球采血，每个点3只平行采样，血样置于1.5mlEP管中，室温静止10min后，1200RPM离心10min，吸取上层血清备用。(让血液自由滴落，尽量不要沾壁，防止溶血)2.供试品制备精密量取血浆样品150μl，加入乙腈850μl（作用为除去蛋白），涡旋振荡5min，10000RPM离心8min，取上清液20μl进高效液相色谱检测。记录色谱图、阿司匹林原型药物与其代谢产物水杨酸峰面积(As)，根据标准曲线计算血浆中阿司匹林与水杨酸的浓度。3.液相色谱条件色谱柱：C18（4.6x150,5μm），流动相：乙腈-5%冰醋酸水溶液（20:80），检测波长为303nm或275nm.4.标准曲线制备(1)水杨酸标准曲线分别取水杨酸40mg，精密称定，置10mL容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，得到4.0mg/mL水杨酸的贮备液，用乙腈分别稀释成不同浓度的系列溶液（4000、2000、800、200、80、20μg/mL）（母液）。取6支5mLEP管，分别加入0.15mL空白血浆，各支分别加入50μL水杨酸系列溶液，再加入乙腈1.8ml，涡旋振荡5min，15000RPM离心8min，得工作液水杨酸浓度分别为0.5、2、5、20、50、100μg/ml。取上清液20μL用高效液相分析检测。以As为纵坐标，水杨酸浓度C(μg/mL)为横坐标，直线回归，求算标准方程及R值。(2)阿司匹林标准曲线分别取阿司匹林40mg，精密称定，置10mL容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，得到4.0mg/mL阿司匹林的贮备液，用乙腈分别稀释成不同浓度的系列溶液（4000、2000、800、200、80、20μg/mL）（母液）。取6支5mLEP管，分别加入150μL空白血浆，各支分别加入500μL阿司匹林系列溶液，再加入乙腈350μL，涡旋振荡5min，15000RPM离心8min，得工作液阿司匹林浓度分别为10、40、100、400、1000、2000μg/mL。取上清液20μL用高效液相分析检测。以As为纵坐标，阿司匹林浓度C(μg/mL)为横坐标，直线回归，求算标准方程及R值。5.血样中药物浓度测定及血药浓度-时间曲线的绘制方法作图:综合各组动物数据，每三个样本合为一组，计算其平均值及SD，按照在坐标纸上以血药浓度-时间描点作图。同时学习常用作图软件（eg.GraphPad），学习用软件绘制时间-血药浓度曲线。6.根据血药浓度和动力学公式计算相关动力学参数用线性回归法求出口服给药后阿司匹林的药代动力学参数（Cmax,tmax,K,Ka,t1/2,CL），同时计算AUC0-t与AUC0-∞（积分法或梯形法）。学习使用DAS软件计算各药代动力学参数。