第三章 基因工程的奇迹

第三章基因工程的奇迹3.1DNA双螺旋DNA—脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）1953年，詹姆斯·沃森（JamesWatson）和弗朗西斯·克里克（FrancisCrick）共同发现了DNA双螺旋结构，他们的发现从此改变了人类对自身的认识。DNA的构造元件是核苷酸一分子戊糖一个磷酸基团一种碱基组成核苷酸之间由磷酸二酯键连接碱基之间通过氢键连接A和T数量相当，G和C数目一致，符合碱基当量规则。遗传信息就储存在这些碱基序列中3.2遗传密码RNA——核糖核酸（ribonucleicacid）RNA中尿嘧啶(U)取代了DNA中胸腺嘧啶(T)RNA有3种：mRNA（信使RNA）rRNA（核糖体RNA）tRNA（转运RNA）均由RNA聚合酶以DNA为模板转录出来RNA聚合酶与新合成的RNADNARNARNA聚合酶真正携带着蛋白质信息的是mRNA！DNA编码片段复制产生mRNA的过程称为转录（transcription）结构基因：外显子+内含子外显子（exon）：真核基因中遗传信息的编码区段。内含子（intron）：真核基因中不能编码蛋白质的区段。只携带蛋白质编码信息的mRNA就是成熟的mRNA几个不同的三联体密码子编码相同的氨基酸，称为密码子的兼并性。缬氨酸丙氨酸亮氨酸由6种不同的密码子编码如：都是由4种不同的密码子编码为什么无法准确的从蛋白质序列推定相应的DNA序列？UAA,UAG,UGA：肽链翻译的终止信号AUG(编码甲硫氨酸)：真核生物中的翻译起始信号鬼笔鹅膏产生的α-鹅膏菌素能够导致RNA聚合酶不可逆转的失活。3.3蛋白质生产工厂——核糖体核糖体一个大亚基一个小亚基蛋白质+rRNAtRNA的作用：将活性状态的氨基酸结合到核糖体上。tRNA是一种三叶草结构蛋白质的合成过程3.4重组（recombination）定义：将来源于两种或更多种生物的基因区段重新排列组合。基因重组是基因工程必不可少的重要一步！3.4.1质粒——遗传重组的理想载体携带外源基因进入受体细胞进行扩增和表达的工具叫做载体（vector）。质粒：存在于细菌体内并独立于细菌染色体之外的能够自我复制的小的闭合环状的双链DNA。大肠杆菌的质粒通过结合建立起来一道“桥”来交换质粒细菌具有的抗药性并非是质粒直接赋予的，而是质粒所携带的抗菌素抗性基因表达出的酶能够使那些抗菌素失活，它把这种特性给予了细菌，使细菌也具有了相应的抗生素抗性。质粒的一般生物学特性a.质粒大小为1-200kb不等，可以“友好”地借居在宿主细胞中。b.质粒最重要的编码特性是对抗菌素具有抗性。氨苄青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四环素抗性（Tetr）链霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）c.质粒具有3种不同的构型：超螺旋(SC)、开环(OC)、线性(L)d.质粒有2种不同的复制类型，严紧型质粒（stringentplasmid）和松弛型质粒（relaxedplasmid）。e.质粒具有不亲和性，也叫不相容性。目前基因工程技术中使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC101：8.8kb，拷贝数5，四环素抗性标记基因TCrColE1：6.5kb，拷贝数20-30，大肠杆菌内毒素标记基因E1rRSF2124：ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标记基因Apr抗菌素选择原理当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能在含有抗菌素的培养基中生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。活死抗性基因抗菌素为什么质粒可以作为遗传重组的载体？斯坦福大学的质粒专家Cohen：在体外，质粒能够“走私”外源DNA（形成重组体），然后象布谷鸟一样将自己的蛋（重组体）下到别家的鸟窝（细菌细胞）里。3.4.2限制性核酸内切酶和DNA连接酶——分子级别的剪刀和胶水限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并由此产生切割的一类内切酶。①能够识别由4-8个核苷酸组成的具有回文对称结构的序列EcoRI的切割位点EcoRI的识别序列5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’基本特性：②DNA分子有二种断裂类型一是具有粘性末端的DNA片段。如EcoRⅠ、PstⅠ粘性末端：指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。EcoRI产生的5’粘性末端PstI产生的3’粘性末端第二种具有平末端的DNA片段。如EcoRⅤ、PvuⅡ具有平末端的DNA片段不易于重新环化②DNA分子有二种断裂类型一是具有粘性末端的DNA片段。如EcoRⅠ、PstⅠPvuII产生的平头末端③同位酶、同裂酶、同尾酶同位酶（isoschizomers）：来源不同的限制酶可识别相同的DNA序列，但是在序列中切割位置却不同。如：XmaⅠCCCGGGSmaⅠCCCGGGGGGCCCGGGCCC同裂酶（isoschizomers）：来源不同的限制酶识别同样的核苷酸靶序列，产生同样的切割，形成同样的末端。如：SstⅠCCGCGGSacⅠCCGCGGGGCGCCGGCGCC同尾酶（isocaudamers）：来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。常用的限制酶BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。如HindⅢ，前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“d”表示菌系为d型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRⅠ---EsoherichiacoliRⅠSacⅠ---StreptomycesachromagenesⅠDNA连接酶（DNAligase）:能够催化DNA双链上相邻的3’-OH和5’-P共价结合形成3’-5’磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来的酶。最常用T4—DNA连接酶，来源于T4噬菌体T4—DNA连接酶的基本性质(2)修复RNA—DNA杂交双链上缺口处的磷酸二酯键(3)连接完全断开的两个平头双链DNA分子3.5基因技术的第一次尝试——呱呱落地的细菌S.CohenandH.Boyer1972年，他们共同开创基因技术的第一次实验TCKanTCKanTC具有双抗性的重组工程菌呱呱落地了!“爪蟾-细菌”融合质粒从中得到的更重要的东西：一种基因工程普遍适用的方法——DNA克隆技术得以发展，它能够制造和分析大量高等生物的遗传材料。3.6如何获得基因为什么真核基因不能在原核细菌中表达？原核生物体内不具有对真核生物基因的内含子进行剪切的功能。获得基因的方法：a.将mRNA逆转录为cDNAb.化学合成基因，前提是基因的序列已知逆转录酶（reversetranscriptase）：将单链mRNA逆转录为双链cDNA(complementaryDNA,互补DNA)的酶。DNA合成仪3.7胰岛素是由胰腺的胰岛细胞分泌的一种非常重要的小分子激素蛋白。I型糖尿病：由于胰腺中胰岛细胞被破坏不能产生胰岛素而引起的，又称胰岛素依赖型糖尿病。II型糖尿病：由于机体的肝脏、肌肉及脂肪细胞等对胰岛素促进葡萄糖的吸收、转化、利用发生了抵抗而导致的。1953年，美国科学家F.Sanger证实了胰岛素的结构，它是由两条多肽链组成的，其中一条有21个氨基酸，称为A链，另一条有30个氨基酸，称为B链。F.Sanger（1918~）人体内胰岛素的合成人体内胰岛素的合成35个氨基酸称为C链，它对于胰岛素的空间构象的正确折叠是必需的，能够保证A链和B链在连接时的正确朝向。24个氨基酸是信号肽，帮助前胰岛素原从内质网进入细胞质中。猪胰岛素与人胰岛素相比，有一个氨基酸序列的差异，人胰岛素B链的末端是苏氨酸，而猪胰岛素B链末端是丙氨酸。胰蛋白酶（trypsin）：一种水解酶a.能够特异水解蛋白质中赖氨酸或者精氨酸旁边的肽段。而猪胰岛素B链末端的丙氨酸恰巧就在赖氨酸后面。b.在无水环境下可以重组肽链（将其它的氨基酸连接到肽链上）。20世纪30年代Hoechst公司生产的猪胰岛素产品广告3.8第一种基因工程胰岛素的诞生1982年，美国EliLilly公司首先开始利用重组大肠杆菌生产人胰岛素。A链和B链的基因分别合成有活性的重组人胰岛素诞生了Humulin（优泌林）重组人胰岛素1982年10月在美国上市，全球第一个商业化基因重组人胰岛素。EliLillyandCompany缺点：A链和B链的连接方向难以确定，二硫键的正确配对率较低，使得每克胰岛素的成本仍高达100美元以上。3.9从单一大肠杆菌菌株中获得人胰岛素合成了除信号肽序列以外的整个胰岛素原基因，即B-C-A的DNA序列。细胞培养这正是现在的医药企业制造胰岛素的方法CNBrBCAβ-Gal多肽链折叠，通过亚硫酸盐氧化半胱氨酸残基活性胰岛素由于C肽的存在，帮助了A链和B链确定正确的连接方向，二硫键的正确配对率相应提高，每克胰岛素最终产品的成本仅50美元。Novolin（诺和灵）1987年，Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产的人胰岛素。NovoNordisk3.10利用转基因哺乳动物细胞生产复合蛋白质复杂的动物和人类蛋白质在发挥作用前，还需要进行糖基化、磷酸化等等一些修饰或加上其他的核酸基团，而原核细菌的细胞内并不能进行这些过程。为什么重组的真核基因在原核细菌里表达出来的蛋白质不具有活性？最好的基因工程细胞表达系统是哺乳动物细胞（mammaliancell）最具代表性的是CHO，中国仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvary,CHO)。真核酵母的局限性：它们缺乏某些特定蛋白质修饰所需的酶或辅因子，或者缺乏使蛋白质正确折叠并形成稳定二硫键的细胞器。