中药物质基础的高效液相色谱分离分析方法研究

中国科学B辑:化学2009年第39卷第8期:678~686中药物质基础的高效液相色谱分离分析方法研究刘艳芳,刘艳明,董军,李伟,王超然,张秀莉,梁鑫淼*中国科学院分离分析化学重点实验室,中国科学院大连化学物理研究所,大连116023*通讯作者,E-mail:[e-mail]收稿日期：2009-06-08;接受日期：2009-06-19摘要高效液相色谱方法已成为中药物质基础研究的重要手段.在中药质量控制、中药标准品制备、活性化合物发现等方面发挥着不可替代的作用.然而我们的实验数据表明,一个中药材可能包含上万个化合物.中药物质基础的复杂性对高效液相色谱方法提出了巨大挑战.本文针对液相色谱方法在中药物质基础分离分析中存在的问题与难点,结合红花、黄连、姜黄三味药材样品,从亲水色谱分离模式、新型色谱固定相、二维液相色谱分离系统和液相色谱质谱联用技术等方面讨论了液相色谱的分离分析方法和发展方向.结果表明,高效液相色谱新技术新方法在中药复杂体系的分离分析中具有很大的发展潜力和应用前景.关键词中药物质基础高效液相色谱质谱联用色谱固定相亲水作用色谱二维高效液相色谱1引言中药作为中华民族的瑰宝,其治病本质在于物质基础.过去的几十年,研究者们对中药物质基础研究做了大量工作,使得人们的认识有了长足的进步.然而,中药物质基础研究仍存在很多问题,如:中药物质基础究竟多么复杂？还应从哪些方面着手深入认识中药物质基础？等等.我们的研究数据已表明:中药是一个极其复杂的物质体系,其复杂性远远超出人们原先的设想.因此中药物质基础研究需在技术和方法上进行重大创新,抓住其中的关键问题,有针对性的开展研究工作,发展新方法,解决新问题.高效液相色谱(HPLC)及其质谱联用(HPLC-MS)技术因强大的分离和高灵敏的检测能力而成为复杂体系分离分析昀为常用的方法之一,在中药质量控制[1~4]、中药活性化合物的分离纯化[5~8]及定性定量分析[9~12]等方面得到了广泛的应用,对中药物质基础研究做出了巨大的贡献.然而当前高效液相色谱的分离能力仍不能满足中药复杂性对分离的要求.因此,探讨高效液相色谱在中药物质基础研究中的难点和发展方向,将有助于其自身发展,使其更好地为中药物质基础研究服务.本文将针对中药物质组成的复杂性,探讨液相色谱分离分析中存在的问题与难点,结合中药实际样品讨论液相色谱的分离分析方法和发展方向,从亲水色谱分离模式、新型色谱固定相和二维HPLC分离系统及HPLC-MS技术等方面进行具体分析.结果表明高效液相色谱在中药复杂体系的分离分析中具有很大的发展潜力,以上四个方面的发展将会显著提高高效液相色谱分离能力,促进中药物质基础深入研究.2材料与方法2.1仪器与试剂Waters2695高效液相色谱系统(包括四元梯度泵、自动进样器、柱恒温系统、2996光电二极管阵列检测器).UPLC/Q-TOF仪器购自Waters公司(美国),中国科学B辑:化学2009年第39卷第8期679带有LockSpray离子质量校正器和电喷雾离子源(ESI).工作站为MassLynx4.1软件(Waters公司,美国).用到的色谱柱有:ACQUITYUPLCBEHRP18色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm,Waters,美国),XTer-raTMMSC18色谱柱(2.1mm×150mm,5μm,Waters,美国),AtlantisHILICSilica色谱柱(4.6mm×250mm,5μm,Waters,美国),ClickOEG-4色谱柱(4.6mm×150mm,5μm,实验室自制),Clickβ-CD色谱柱(4.6mm×150mm,5μm,实验室自制).色谱纯乙腈购自Fisher(新泽西州),色谱纯甲酸购自Acros(美国),色谱纯三乙胺购自Tedia(美国),色谱用水经Milli-Q系统(Millipore,美国)纯化.2.2样品制备2.2.1红花样品制备中药材红花采自新疆塔城,由中国中医科学院西苑医院中药研究室鉴定,避光真空保存于4℃冰箱中.100g红花药材粉碎后置于1L水中,恒温100℃提取120min.过滤,剩余药渣加1L水,继续恒温100℃提取90min.将两次水煎液合并,真空干燥.取粉末约1.5g,溶于15mL水/乙醇(30/70,V/V)中,过滤,将滤液蒸干,用10mL水(25℃)溶解,并过0.45μm滤膜,置于4℃冰箱中保存.本实验重点研究红花中等极性化合物.根据强极性化合物在C18色谱柱上保留很弱的特性,采用C18制备色谱有效除去强极性化合物,收集中等极性化合物.样品制备所用制备柱为XTerraTMprepMSC18(19mm×100mm,5μm,Milford,MA,USA).除特别标明,本文的流动相均为水-0.1%(V/V)甲酸(A1),乙腈-0.1%(V/V)甲酸(B1).四通道进样量均为350μL,流速为16.37mL/min,流动相进入检测器前经1/3000分流.所采用的梯度条件为50min112%25%BB⎯⎯⎯→20min165%B⎯⎯⎯→.馏分按时间收集,合并5~70分钟的馏分,旋转浓缩蒸干,将其溶解于1mL水/乙腈(70/30,V/V)(25℃)中,为实验用红花样品.2.2.2黄连样品制备中药材黄连采自四川石柱县,由中国中医科学院西苑医院中药研究室鉴定,避光真空保存于4℃冰箱中.100g黄连药材粉碎后置于1L水中,恒温100℃提取120min.过滤,剩余药渣加1L水,继续恒温100℃提取90min.将两次水煎液合并,真空干燥.取粉末约1.5g,溶于15mL水/乙醇(30/70,V/V)中,将滤液中的乙醇蒸出后依次用乙酸乙酯和正丁醇分别萃取两次,萃取液干燥后得乙酸乙酯和正丁醇组分,正丁醇组分用水溶解后上AB-8大孔树脂,流出液干燥后得实验所用黄连样品.2.2.3姜黄样品制备中药材姜黄的乙醇提取物购自四川崇州,上XAD-1180大孔吸附树脂,依次用20%、40%和60%乙醇洗脱,实验用样品为60%乙醇洗脱组分.2.3分析方法2.3.1红花样品分析方法在UPLC/Q-TOF分析中,采用ACQUITYUPLCBEHRP18色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm),柱温30℃.流动相梯度条件为20min115%24%BB⎯⎯⎯→10min140%B⎯⎯⎯→,流速为0.25mL/min,进样量为5μL.2.3.2黄连样品的分析方法2.3.2.1黄连样品反相模式分析方法采用XTerraTMMSC18(2.1mm×150mm,5μm)色谱柱,柱温30℃.流动相梯度条件为15%B10min10min5min5min1115%65%95%BBB⎯⎯⎯→⎯⎯⎯→⎯⎯⎯→⎯⎯⎯→195%B,流速为0.2mL/min,进样量为1μL.2.3.2.2黄连样品亲水模式分析方法采用AtlantisHILICSilica(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,柱温30℃.流动相为水-0.0005%(V/V)三乙胺(A2),乙腈-0.0005%(V/V)三乙胺(B2).流动相梯度条件为30min15min2295%85%BB⎯⎯⎯→⎯⎯⎯→50%5min2250%BB⎯⎯⎯→,流速为1mL/min,进样量为5μL.2.3.3姜黄样品的分析方法采用本实验室自制的ClickOEG-4(4.6mm×150刘艳芳等:中药物质基础的高效液相色谱分离分析方法研究680mm,5μm)色谱柱,柱温30℃.流动相为水-0.3%(V/V)甲酸(A3),乙腈-0.3%(V/V)甲酸(B3).流动相梯度条件为10min45min335%5%BB⎯⎯⎯→⎯⎯⎯→5min3350%80%BB⎯⎯⎯→,流速为1mL/min,进样量为5μL.2.3.4红花样品二维分析方法在2D-HILIC/RPLC-UPLC分析中,第一维分析采用Clickβ-CD色谱柱,柱温30℃.流动相梯度条件为25min20min1112%12%40%AAA⎯⎯⎯→⎯⎯⎯→,流速为1.0mL/min,进样量为20μL.手动收集馏分,从1.8~44.8min每分钟一个馏分,依次记为Fraction1、Fraction2……Fraction43.馏分用氮气吹干后溶于100μL乙腈/水(5/95,V/V)中,并保存在4℃冰箱中.第二维分析采用ACQUITYUPLCBEHRP18色谱柱,柱温保持在30℃.流动相梯度条件为5%20min10min22224%40%BBB⎯⎯⎯→⎯⎯⎯→,流速为0.25mL/min,每个馏分的进样量均为5μL.2.3.5红花样品质谱条件Q-TOFPremier质谱采用ESI正离子检测.氮气流速为800L/h,氮气温度为300℃.锥孔气流速为50L/h,离子源温度是120℃.毛细管电压设为3.0kV.锥孔电压设为45V.Q-TOFPremier的采样速率是1.0s,内部扫描延迟0.02s.氩气作为碰撞诱导解离的气体,碰撞电压分别是5eV.扫描范围是50~1000m/z.以棒图的形式记录谱图.所有的分析在参比样品的对照下进行以保证分子量计算的准确和重复.亮氨酸脑啡肽作为参比样品,浓度为50pg/mL,进样速度为10μL/min.参比样品的[M+H]+离子是556.2771Da.质谱交替采集样品和参比样品的数据.参比样品的数据采集时间固定为1s.原始数据用MassLynx软件分析(Waters,V.4.1).2.4数据分析质谱分析所产生的数据采用MarkerlynxAppli-cationManagerVersion(Waters,英国)进行分析.该软件中,保留时间范围设为1~30min.质量范围设为50~1000Da,质量偏差设为50ppm,昀小强度设为50,保留时间偏差设为0.2s.在统计过程中采用ApexTrack峰积分模式来检测色谱峰,排除了同位素峰及噪音信号的影响.该软件对LC/MS的分析结果以保留时间、m/z及其相应强度的形式输出.3讨论与结论3.1中药物质组成极其复杂中药的复杂性已被人们所共识.图1为RP-图1红花样品在RP-UPLC中的分析谱图(a)为280nm波长下色谱图;(b)Q-TOF质谱总离子流图中国科学B辑:化学2009年第39卷第8期681UPLC/Q-TOF对常用中药红花样品分析的色谱图,从图上我们可以清晰地看到,整个分析时间内都是色谱峰,且大部分峰没有完全基线分离.将质谱数据经Markerlyn提取和比对,30min共检测到6027个不同的离子(色谱保留时间不同或质核比不同).由于色谱峰重叠现象的普遍存在,在质谱检测过程中会不可避免地产生离子抑制效应,红花样品中真实存在离子个数应该大于6027.这提示我们:中药物质组成极其复杂,而我们对其认识十分有限,高效液相色谱的分离能力不足以满足中药复杂性的要求,需要进行深入研究,发展亲水色谱模式、新型色谱固定相和二维HPLC分离系统及HPLC-MS技术.3.2亲水色谱模式在中药复杂体系中的应用反相高效液相色谱法(RP-HPLC),以C18固定相为代表,是目前发展昀成熟、应用昀为广泛的分离方法之一.它对中等极性和弱极性化合物可以实现较好的分离,但对强极性化合物的保留很弱甚至不保留.因此,中药强极性化合物缺乏有效的分离方法,研究报道较少.近年来,亲水作用色谱(HILIC)因其对强极性化合物具有较好的分离而迅速发展起来,它的选择性与C18完全不同,可以对C18上不保留的化合物实现较好的分离[13~15].另外,亲水作用色谱采用高有机相比例的流动相,其质谱检测的灵敏度更高[15].我们将亲水作用色谱模式应用于中药强极性化合物的分离中,获得了很好的结果.图2(a)为黄连样品采用反相模式分离的色谱图,死时间附近有紫外响应很高的大峰出现,说明样品中含有大量的强极性化合物,反相C18对这些化合物几乎没有保留.采用HILIC模式对该样品进行分离,从图2(b)上可以看出,49个色谱峰被分离出来,而我们采用通常的反相色谱模式是