贵州大学生物显微及超微技术实验教学大纲(超微技术部分)

贵州大学生物显微及超微技术实验教学大纲（超微技术部分）一、教学目的与要求掌握透射电镜和扫描电镜的基本知识；了解透射电镜和扫描电镜的工作原理；了解其它新型电镜；掌握样品常规制备技术；了解免疫电镜、电镜细胞化学、冷冻蚀刻等技术；掌握正常细胞超微结构；了解细胞超微结构病理形态。使学生掌握电镜在生物医学领域中的使用方法。二、课程内容教师：刘忠伟电话：[phone]E-Mail:[e-mail]序号实验名称备注实验一透射电镜、扫描电镜的结构与工作原理介绍电子显微镜的常规制样技术介绍2学时实验二植物花粉、叶片的扫描电镜观察4学时实验三微生物、动物的扫描电镜观察4学时实验四微生物样品（细菌、病毒）的负染色制备与观察6学时实验五超薄切片技术10学时实验六细胞超微结构的透射电镜观察6学时实验一透射电镜、扫描电镜的结构与工作原理介绍电子显微镜的常规制样技术介绍（理论课）㈠序言1．电镜发展史2．电镜在生物医学中的作用3．电镜进展：超高压电镜、扫描透射电镜、扫描隧道显微镜、分析电镜等4．电镜与其它显微镜的区别㈡透射电镜透射电镜、扫描电镜的结构与工作原理介绍1．概述2.基本原理3．结构和操作㈢扫描电镜1．概述2．成像原理3.结构和操作㈣超薄切片技术1．电镜对标本的要求2．标本制备过程3．人工假象问题㈤扫描电镜样品制备1．取材和予处理2．生物样品干燥3．生物样品导电㈥免疫电镜1．概述2．方法3．免疫金探针技术㈧细胞超微结构1．正常细胞超微结构2．超微结构的病理变化3．人工假象实验二叶片气孔及表皮细胞、花粉的扫描电子显微镜观察一、教学目的与要求掌握扫描电镜的基本知识和工作原理，掌握扫描电镜植物样品常规制备技术；了解扫描电镜下植物组织的微观结构形态，熟悉扫描电子显微镜的操作。二、课程内容1、叶片气孔、表皮细胞观察：取成熟植物叶片清洗后，切取中部约5mm长的小段，经2.5％戊二醛4℃固定12h以上，用0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗1次。于26℃（即叔丁醇液态之温度）条件下用30%、50％、70％、90％的叔丁醇/酒精混合液各脱水5min；100％叔丁醇脱水两次，每次5min；将试管中叔丁醇抽干，置4℃5～10min，待叔丁醇变为固态，冷冻干燥30～60min；将脱水处理过的样品用导电胶粘在样品台上，离子溅射仪镀金膜，S-3400N扫描电镜观察并拍照。2、花粉：取新鲜成熟的花粉，置于防尘处自然干燥（因花粉含水量少，可以采用直接干燥法观察）。而后粘于导电胶上，用离子溅射仪镀金膜，扫描电镜观察并拍照。实验三微生物、小动物的扫描电子显微镜观察一、教学目的与要求掌握扫描电镜的基本知识和工作原理，掌握扫描电镜微生物、动物样品常规制备技术；了解扫描电镜下微生物、动物组织的微观结构形态，熟悉扫描电子显微镜的操作。二、课程内容1、微生物样品的制样方法：细菌液体培养一段时间后，2000转离心弃上清，而后用2.5％戊二醛在4℃条件下固定12h，用0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗数次，以便洗去固定剂；然后用1%锇酸溶液后固定1h，0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗数次。在叔丁醇液态条件下用30%、50％、70％、90％的叔丁醇/酒精混合液各脱水5min；100％叔丁醇脱水两次，每次5min；将试管中叔丁醇抽干，置4℃5～10min，待叔丁醇变为固态，冷冻干燥30～60min；将脱水处理过的样品用导电胶粘在样品台上，离子溅射仪镀金膜，S-3400N扫描电镜观察并拍照。2、小动物及动物组织的制样方法：取样品清洗后，用2.5％戊二醛4℃固定12h以上，再用0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗数次，然后用1%锇酸溶液后固定1h，0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗数次。余下的步骤与1相同。实验四负染色一、教学目的与要求掌握透射电镜的基本知识和工作原理，掌握透射电镜负染色样品的制备技术；了解透射电镜下负染色样品的微观结构形态，熟悉透射电子显微镜的基本操作。二、课程内容1、原理：负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的。在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色，背景因未被染色呈光亮。而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)包埋低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像透明地光亮。与超薄切片正好相反，故称为负染色。对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高(可达15Å)，简单快速等优点。因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。2、负染试剂：目前最常用的负染液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠。此外醋酸铀、甲酸铀、硅钨酸、钼酸铵等也常作负染色剂用。配制方法如下：•磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1％～3％的溶液，使用时应用1M氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4～7.0。3、染色方法•悬滴法用一根细滴吸管吸一滴样品悬液滴在有膜的铜网上，滴样时要防止铜网被液体吸到管上来或翻转而被污染。如果用Formvar膜时，在制好膜后，可以直接在粘于滤纸上的铜网进行负染色操作。如果用碳膜时，要用镊子夹着铜网，滴液后静置数分钟，然后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2分钟用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水滴在铜网上洗1～2次，用滤纸吸去水，待干后可用于电镜观察。图片：负染色的腺病毒实验五、超薄切片技术一、教学目的与要求1.掌握超薄切片的基本要求和制作程序。2.掌握取材的基本方法和要求。3.掌握常用的固定剂及固定方法。4.了解脱水、浸透与包埋、切片、染色等的基本操作方法和注意事项。二、课程内容1.超薄切片的概念和基本要求，基本制作程序。2.取材的概念，取材前的准备工作，取材的基本要求和方法。3.固定的目的，理想的常用固定剂及其配制，固定的方法和固定时的注意事项。4.脱水的目的，常用的脱水剂，脱水方法和脱水时注意的问题。5.浸透与包埋的目的，常用的包埋剂，浸透和包埋的方法，包埋中应注意的问题。6.切片的步骤，玻璃刀的制作，切片厚度的简单识别方法。7.切片的目的；正染和负染的概念；醋酸双氧铀—柠檬酸铅双染法中染色剂的配制、染色步骤、方法及注意事项。8.超薄切片质量的判断。三、透射电镜标本制备和观察1、取材（植物叶片、根、茎等）；2、固定；3、脱水；4、浸透；5、包埋；6、超薄切片；7、电子染色；8、电镜观察。实验六、细胞超微结构的透射电镜观察一、教学目的与要求掌握透射电镜的基本知识和工作原理，掌握透射电镜超薄切片样品的制备技术；了解透射电镜下超薄切片样品的微观结构形态，掌握正常细胞超微结构，熟悉透射电子显微镜的基本操作，学会阅电镜底片和电镜照片。二、课程内容1、高压先加到120KV，再从120KV160KV200KV依次升高；严禁直接加到200KV。2、开启灯丝，观察样品，每次换样要将样品杆还原到零位置（PropertyStageHolderexchange）。3、选取超薄切片厚度适中的样品，经染色后，上机观察。4、重点观察植物组织细胞膜、叶绿体、线粒体、高尔基体、核糖体、细胞骨架结构等细胞超微结构，能够进行分辨细胞超微结构，能够阅读电镜底片和电镜照片。5、观察结束，关灯丝；高压依次从200KV160KV120KV降低，至120KV直接关高压。教材或主要参考书1、《生物电子显微镜技术》张景强、朴英杰主编，中山大学出版社2.《生物医学超微结构与电子显微镜技术》洪涛主编，科学出版社3.《实用生物电子显微技术》林钧安、高锦梁主编，辽宁科学技术出版社4.《生物电子显微镜技术》上海第二医学院生物物理教研室编5.《免疫电镜方法》樊景禹主编，北京医科大学6.《扫描电镜技术及其应用》郭素枝主编，厦门大学出版社7.BiologicalTransmissionElectronMicroscopyBrendaS.Weakley.ChurchillLivingstoone8.TechniquesforelectronmicroscopyBradleyDE.Blackwell