第三章酶工程在食品工业中的应用

第三章酶工程在食品工业中的应用第一节酶工程的概况一、酶工程发展历史二、酶的基本概念、分类与命名三、酶的活力测定四、微生物发酵产酶五、酶的提取与分离纯化六、酶与细胞固定化七、酶分子修饰八、酶反应器及反应操作控制一、酶工程发展历史酶的生产和应用的技术过程称为酶工程，其主要任务是通过预先设计，经人工操作而获得大量所需的酶，并创造各种条件使酶发挥最有效的催化功能。随着对酶的深入研究、酶提取分离技术的不断出现，酶已广泛应用在各个领域中，利用酶制剂改进生产工艺，提高产品的质量和产率，降低生产成本。人们对酶的认识经历了一个不断发展、逐步深入的过程。1808年，胰蛋白酶被用来软化皮革；1917年，法国人用淀粉酶作纺织工业上的退浆剂；1949年，日本人采用深层培养法生产淀粉酶。1953年，德国的格鲁布霍费(Grubhofer)和施来斯(Schleith)首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与上述载体结合，制成固定化酶。酶的固定化可解决酶制剂的稳定性和重复使用的问题，是酶工程发展的里程碑。1969年，日本人首次在工业上应用固定化氨基酰化酶拆分法生产L—氨基酸；1973年，日本成功地利用固定化大肠杆菌菌体（死细胞）中的天门冬氨酸酶，以反丁烯二酸为底物连续生产L—天门冬氨酸。迄今为止，酶工程应用范围已遍及工业、农业、医药卫生行业、环保、能源开发和生命科学等各个方面。特别是近20年来，由于蛋白质工程、基因工程和计算机信息等新兴高科技的发展，使酶工程技术得到了迅速发展和应用，各种新成果、新技术、新发明不断涌现。二、酶的基本概念、分类与命名（一）酶基本概念（二）酶的分类（三）酶的命名（一）酶基本概念酶是生物催化剂，它与非生物催化剂相比有以下的特性：（1）催化效率高，酶催化反应速度是相应的无催化反应的108-1020倍，比非酶催化反应速度高几个数量级。（2）专一性高，酶对反应的底物都有极高的专一性，几乎没有副反应发生。（3）反应条件温和，在常温、常压以及中性的pH环境下。（4）活性可调节，酶的活性通过别构调节、酶的共价修饰、酶的合成与降解等来调节酶的活性。（5）酶的催化活性离不开辅酶、辅基以及金属离子的作用。（二）酶的分类(1)氧化还原酶在体内参与产能、解毒和某些生理活性物质的合成，包括各种脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等。(2)转移酶在体内将某基团从一个化合物转移到另一化合物，参与核酸、蛋白质、糖及脂肪的代谢与合成的酶。(3)水解酶在体内外起降解作用的酶类，水解酶一般不需辅酶。(4)裂合酶脱去底物上某一基团而形成双键，或可在双键处加成某一基团的酶。(5)异构酶催化分子异构化的酶类。(6)连接酶或合成酶这类酶关系很多生命物质的合成，其特点是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需金属离子辅助因子。分别形成C—O键(与蛋白质合成有关)、C--S键(与脂肪酸合成有关)、C--C键和磷酸酯键。（三）酶的命名1．习惯用名许多酶是由底物名称加上后缀“—ase'’命名。如脲酶(urease)是催化尿素(urea)水解的酶；果糖-1，6-二磷酸酶(fructose-1,6-diphosphatase)是水解果糖-1,6-二磷酸的酶。2．系统命名法要写出酶作用的所有底物、酶作用的基团及催化反应的类型等详细情况。如在胰蛋白酶(EC3.4.21.4)中，第一个数字“3”表示它是水解酶；第二个数字“4”表示它是蛋白酶水解肽键；第三个数字“21”表示它是丝氨酸蛋白酶，在活性部位上有一至关重要的丝氨酸残基；第四个数字“4”表示它是这一类型中被指认的第四个酶。三、酶的活力测定（一）酶活力与酶促反应速度酶活力是指在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度；酶促反应速度是指单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。（二）酶的活力单位（U）在国际上，酶的活力单位定义为在最适反应条件下，每分钟催化1µmol底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位（IU）。另一个酶的活力定义为在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，称Kat单位：1Kat=6×107IU定义中的最适条件是指最适温度、最适pH、最适缓冲液离子强度以及最适底物浓度。三、酶的活力测定（三）酶的比活力酶的比活力是指酶蛋白所具有的酶活力，单位为U/mg蛋白质，酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标。（四）酶活力的测定方法酶活力的测定方法主要有分光光度法、荧光法、同位素法和电化学法。四、微生物发酵产酶（一）产酶细胞的要求（二）酶发酵生产常用的微生物（三）提高酶产量的措施（一）产酶细胞的要求（1）酶的产量高高产细胞可以通过诱变筛选野生菌株或采用基因工程、细胞工程等技术构建工程菌而获得。对于野生菌株，可以通过含酶菌种的收集、富集培养、分离纯化、条件优化等操作获得。（2）容易培养和管理产酶细胞容易生长繁殖，适应性较强，易于控制，便于管理。（3）产酶稳定性好在通常的生产条件下，能够稳定地用于生产，不易退化；一旦发生退化，可以经过复壮处理恢复产酶能力。（4）利于酶的分离纯化发酵完成后，要求产酶细胞本身及其他杂质易于和酶分离。（5）安全可靠细胞及其代谢物安全无毒，不会影响生产人员和环境，不会对酶的应用造成不良的影响。（二）酶发酵生产常用的微生物（1）枯草芽抱杆菌用于生产淀粉酶、蛋白酶等胞外酶。如枯草芽抱杆菌BF7658是国内生产淀粉酶的主要菌株，枯草芽抱杆菌S1.39B用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸酶。（2）大肠杆菌大肠杆菌可生产多种胞内酶。如天门冬氨酸酶、苄青霉素化酶、半乳糖苷酶、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶和核酸外切酶等。（3）黑曲霉黑曲霉可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。如糖化酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核搪核酸酶、脂肪酶、纤维素酶等。（4）米曲霉米曲霉是生产糖化酶和蛋白酶、氨基酰化酶和磷酸二脂酶等。（二）酶发酵生产常用的微生物（5）青霉产黄青霉用于生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、果胶酶、纤维素酶。桔青霉用于生产磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S1等。（6）木霉生产纤维素酶的重要菌株。木霉产生的纤维素酶有C1酶、Cx酶和纤维二糖酶等；还含有较强的17a-羟化酶，常用于甾体转化。（7）根霉用于生产糖化酶、淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。还含有较强的11a-羟化酶，常用于甾体转化。（8）毛霉用于生产蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。（二）酶发酵生产常用的微生物（9）链霉菌链霉菌是一种放线菌，是生产葡萄搪异构酶的主要菌株，还用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。（10）啤酒酵母用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。（11）假丝酵母用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、醇脱氢酶。假丝酵母具有烷烃代谢的酶系，可用于石油发酵，具有较强的17a-羟化酶。（三）提高酶产量的措施1．添加诱导物2．控制阻遏物浓度3．添加表面活性剂4．添加产酶促进剂1．添加诱导物发酵培养基中添加适当的诱导物，可使诱导酶的合成大量提高。不同的酶有各自不同的诱导物。2．控制阻遏物浓度（1）产物阻遏作用如枯草杆菌碱性磷酸酶受其反应产物无机磷酸的阻遏：当培养基中无机磷含量在1.0µmol/mL以上时，该酶的合成完全受阻遏。为提高碱性磷酸酶的产量，必须限制培养基中无机磷的含量。（2）分解代谢物阻遏作用在培养基中有葡萄糖时，即使有半乳糖苷诱导物存在，半乳糖苷酶受葡萄糖分解代谢物阻遏而无法产生。减少或解除分解代谢物阻遏作用的方法有控制葡萄糖等容易利用的碳源的浓度；采用其他较难利用的碳源(如淀粉等)；采用补料，即分次添加碳源的方法；在分解代谢物存在的情况下，加一定量的cAMP，可以解除分解代谢物阻遏作用。3．添加表面活性剂表面活性剂可分为离子型和非离子型两大类。前者又有阳离子型、阴离子型和两性离子型。离子型表面活性剂有些对细胞有毒害作用，不能用于发酵生产；非离子型表面活性剂，如吐温(Tween)、特里顿(Triton)等，可积聚在细胞膜上，增加细胞的通道性，有利于酶的分泌，所以可增加酶的产量；以及有利于提高某些酶的稳定性和催化能力。例如，在霉菌发酵生产纤维素酶的培养基中，添加1％的吐温，可使产量提高1-20倍。4．添加产酶促进剂产酶促进剂是指可以促进产酶量，但作用机制并未阐明清楚的物质。植酸钙可提高霉菌蛋白酶和桔青霉磷酸二脂酶的产量1～20倍。聚乙烯醇(Polyvinylalcohol)可提高糖化酶的产量。五、酶的提取与分离纯化（一）酶提取的主要方法（二）酶提取过程的注意事项（三）酶的分离纯化的一般原则（一）酶提取的主要方法1.盐溶液提取2.酸溶液提取3.碱溶液提取4.有机溶剂提取1.盐溶液提取大多数酶溶于水，在一定的盐浓度条件下，酶的溶解度增加；但盐的浓度太高，则酶溶解度反而降低，出现酶沉淀析出。因此，一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在0.02～0.5mol/L的范围内。例如，固体发酵生产的麸曲中的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mol/L的NaCl溶液或0.02～0.05mol/L的磷酸缓冲液提取；酵母醇脱氢酶用0.5～0.6mol/L的磷酸氢二钠溶液提取；6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L的碳酸钠提取；枯草杆菌碱性磷酸酶用0.1mol/L的氯化镁提取等。2.酸溶液提取有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，适宜用酸液提取。例如从胰脏中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶用0.12mol/L的硫酸溶液进行提取。3.碱溶液提取有些酶在碱性条件下溶解度较大且稳定性较好，应采用碱溶液提取。例如，细菌L-天门冬酰胺酶的提取是将含酶菌体悬浮在pH11~12.5的碱溶液中。4.有机溶剂提取有些与脂质结合比较牢固，或分子中含非极性基团较多的酶，不溶或难溶于水、稀酸、稀碱和稀盐溶液中，需用有机溶剂提取。常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、丙酮和丁醇等。其中丁醇对脂蛋白的解离能力较强，提取效果较好，已成功地用于琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、胆碱酯酶等的提取。（二）酶提取过程的注意事项1．温度•为了防止酶的变性失活，提取时温度不宜高。特别是采用有机溶剂提取时，温度应控制在-10℃。有些酶对温度的耐受性较高，如酵母醇脱氢酶、细菌碱性磷酸酶、胃蛋白酶，可在37℃或更高一些温度下提取。2．pH•提取时溶液的pH值应该远离酶的等电点，可增加酶的溶解度。除了酸溶液提取或碱溶液提取，提取时溶液的pH不宜过高或过低，以防止酶的变性失活。3．提取液的体积•提取液的用量增加，可提高提取率，但是过量的提取液，使酶浓度降低，对进一步的分离纯化不利，故提取液的用量一般为含酶原料体积的3-5倍，可一次提取。4．添加保护剂•在酶提取过程中，为了提高酶的稳定性，防止酶变性失活，可以加入适量的酶作用底物，或其辅酶，或加入某些抗氧化剂等保护剂。（三）酶的分离纯化的一般原则1．原料来源广泛，成本低廉；目标酶含量高、活力强；可溶性和稳定性好。2．注意防止酶的变性和失活•细胞破碎后，目标酶和溶酶体中水解酶等会混合在一起，变性的机会大大增加。因此，破碎细胞的条件要尽可能温和，尽早尽可能多地去除各种杂质等；设法避免过酸、过碱、重金属离子、变性剂、去污剂、高温、剧烈震动等不利因素；加入蛋白水解酶的抑制剂。3．建立适宜的检测手段•建立灵敏、特异、精确的检测手段是评估目标酶蛋白的产量、活性、纯度的前提。4．纯化策略的选择•充分利用目标酶蛋白的特点，如溶菌酶热稳定性好，可在高温下处理，使杂蛋白变性；如目标酶蛋白的性质并不特异，通常先运用非特异、快速、低分辨的方法，如硫酸铵沉淀、超滤和吸附等操作尽快缩小样品体积，提高目标酶蛋白的浓度，实现粗分离；随后可利用具有高选择性的凝胶过滤、离子交换、色谱聚焦、疏水作用、亲和分离等操作进行精分离。5．细胞破碎•为了分离提取胞内酶，就先收集细胞及破碎。细胞破碎的方法有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法等。实际使用时可根据具体情况