第二章兰州大学基因工程基因工程酶学基础

第二章基因工程的酶学基础第一节限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)•是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶限制性核酸内切酶•主要来源于原核生物•1968年，Dr.WernerArber,Dr.DanielNathan和Dr.HamiltonSmith博士第一次从大肠杆菌中提取出限制性内切核酸酶•已经分离提取出500多种限制性内切核酸酶1、来源及发现Dr.WernerArber内切酶，即在核酸分子内部制造切口的酶形成5`-P和3`-OH末端2性质3功能自我保护作用细菌的限制和修饰系统（R/M体系）a限制（Restriction）•限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA分子进行分解，切成小片段AABBBBBb修饰（Modification）•细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割c限制修饰系统分子机理•由三个连续基因位点所控制：hsdR,hsdM,hsdS•hsdR---限制性内切酶:能识别DNA分子上的特定位点并将双链DNA切断•hsdM---限制性甲基化酶:催化DNA分子特定位点上的碱基甲基化反应•hsdS---控制两个系统的表达:协助上述两种酶识别特殊的作用位点•宿主细胞内的甲基化酶将自身DNA和噬菌体DNA实施特异性保护，封闭了自身限制性酶的识别位点•这种限制不完全，总有少数入侵DNA会存活，得以在宿主细胞内复制，并被宿主的甲基化酶修饰，但同时，也丧失了原宿主甲基化酶标记d意义•寄主控制的限制与修饰是一种广泛的过程，广泛存在于原核细菌中。有两方面作用：•保护自身DNA不受限制•破坏外源DNA，使之迅速降解二限制性内切酶的命名•命名：–EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：酶编码基因所在质粒；Ⅰ：发现次序)三限制性内切酶类型•目前鉴定出3种不同的限制性内切酶•I型限制性内切酶•II型限制性内切酶•Ⅲ型限制性内切酶限制性内切酶的类型及其主要特性特性I型II型III型限制和修饰活性单一多功能的酶分开的核酸内切酶和甲基化酶具有一种共同亚基的双功能的酶核酸内切限制酶的蛋白质结构3种不同的亚基单一的成份2种不同的亚基切割位点在距寄主特异性位点至少1000bp的地方可能随机地切割位于寄主特异性位点或其附近距特异性位点3，端24~26bp处甲基化作用的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点识别未甲基化的序列进行核酸内切酶切割能能能序列特异的切割不是是是DNA克隆中的用处无用十分有用用处不大II型限制性内切酶的基本特性•1970年，由H.O.smith和K.W.wilcox从流感嗜血菌中分离得到如HindII（1）识别位点未甲基化修饰的特异靶序列，多数呈中心对称的回文结构，由4-8个碱基组成，有些识别位点是连续的，有些则是间断的，如GANTCC-A-Pu-Py-T-GG-T-Py-Pu-A-C5'3'5'3'（2）切割位点EcoRⅠGAATTCCTTAAG5′3′5′3′5′GCTTAAAATTCG3′3′5′粘性末端SmaⅠCCCGGGGGGCCC5′3′3′5′5′CCCGGGGGGCCC3′3′5′平头末端绝大多数II类酶在其识别位点内切割DNA•粘性末端（cohensiveend）连接便利DNA分子末端标记平末端补齐一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖•同裂酶(isoschizomers)：来源不同，识别的是同样的核苷酸靶序列•同尾酶(isocaudamer)：来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，在基因克隆实验中很有用处•由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，称之为“杂种位点”(hybridsite)。但这类杂种位点的结构，一般不再被原来的任何一种同尾酶所识别影响限制性内切酶活性的因素•1、DNA的纯度•2、DNA的甲基化程度•3、酶切反应的温度•4、DNA的分子结构•5、核酸限制性内切酶的反应缓冲液DNA的纯度DNA的甲基化程度•原核生物限制—修饰体系，对识别序列中特定核苷酸的甲基化，会强烈影响酶活性。在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌，在选用酶时应注意：•所选用的限制酶对甲基化的敏感性•依DNA的不同来源选择不同的限制酶反应温度•大多数的核酸限制内切酶的标准反应温度为37℃，但也有许多例外，如SmaI为25℃，ApaI为30℃，TaqI为65℃•消化反应温度高于或低于最适反应温度，都会影响酶的活性•每ugDNA用1-5U酶切1-2hDNA的分子结构•某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需的酶量比消化线性DNA高出20倍•一些核酸内切酶，切割处于不同位置的限制位点，其效率有明显的差异，可能是由于侧翼序列的核苷酸成分的差异造成的•有些特定的限制位点，只有当其它的限制位点被广泛切割时，才能被有关的核酸限制性内切酶消化•少数酶，如SacII对不同部位的限制位点的切割活性会有很大的差异，其中有些位点很难被切割核酸限制性内切酶的缓冲液•核酸内切酶的标准缓冲液组分：•MgCl2、NaCl/KCl、Tris-HCl、巯基乙醇或DTT以及BSA等•NaCl或Mg2＋浓度：降低酶的活性，导致识别序列特异性改变•Tris-HCl:稳定反应液的pH在酶的最佳pH范围内•巯基试剂：保持酶的稳定性，避免失活•Na、K离子：对部分酶反应敏感，部分酶则适应较广的离子强度的变化幅度酶解反应中的星号活性•星号活性（staractivity）当酶反应体系发生改变时，酶的性能甚至酶切位点发生改变的现象如EcoRI等,在正常条件下，切割5`GAATTC3`，但在甘油浓度5%时,也可切割5`PnPnATPyPy3`或者5`AATT3`限制性内切酶反应的终止•终止后直接电泳检测酶切结果完全消化和部分消化•完全消化•部分消化双酶切的方法•①先用在低离子强度的缓冲液中活性最高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl等金属离子及第二种酶，继续温育•②使用适合于大多数限制酶的单种缓冲液--谷氨酸钾缓冲液(KGB)，可使各种限制酶的活性达到较高使用限制酶的注意事项第二节甲基化酶特征：与限制性内切酶相对应，识别位点相同1.大肠杆菌中的甲基化酶•（1）Dam（腺嘌呤甲基化酶）:此酶可在5`GATC3`序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有5`GATC3`的限制性内切酶不能切割如BclI（TGATCA）•（2）Dcm（胞嘧啶甲基化酶）:此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoRII•2.甲基化酶的用途•就许多II类限制性内切酶而言，都相应存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使其免受切割•甲基化酶的用途是在必要时可以封闭某一限制性内切酶的酶切位点,同时又可能产生新的酶位点•如两个串联的TaqI识别位点经M．TaqI甲基化封闭后，出现了一个依赖于甲基化的限制性核酸内切酶DpnI的切割位点(下图)第三节连接酶广泛存在于各种生物体内，其催化DNA双链上相邻的3`-OH和5`-P共价结合形成3`-5`磷酸二酯键DNA连接酶：大肠杆菌染色体DNA编码,NAD+为能源辅助因子T4DNA连接酶:T4噬菌体DNA编码,ATP为能源辅助因子,能进行平末端DNA片段的连接连接温度：通常37℃，但这时粘末端之间的氢键不稳定，所以温度应界于酶连接速率和末端结合速率之间，一般认为4～15℃较合适•一DNA连接酶的发现1967年，世界多个实验室发现催化DNA双链上相邻的3`-OH和5`-P共价结合形成3`-5`磷酸二酯键的酶•二、特点•2连接条件•3DNA连接酶连接反应条件•三、连接反应机理•四、连接反应温度•五、影响因素•六、反应体系•七、连接操作•八、体外连接DNA片段的几种方法（1）直接用T4DNA连接酶连接（2）同聚物加尾，先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接（3）衔接物用衔接物连接平末端DNA分子（4）DNA接头连接法•平头末端（bluntend）•在识别位点的对称轴上同时切割，如EcoRⅤ•平头末端特点•1、平末端和粘性末端连接方法2、同聚物加尾法3、衔接物法衔接物(1inker)，化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段4、DNA接头法第四节DNA聚合酶•常用的DNA聚合酶：•大肠杆菌DNA聚合酶I•大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片段T4DNA聚合酶•T7DNA聚合酶•逆转录酶•特点：脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的3，-OH末端，催化核苷酸的聚合。其中，T7DNA聚合酶的聚合能力最强1、DNA聚合酶I反应条件用途－DNA杂交探针的制备缺口转移(nicktranslation)2、Klenow酶•用途3、T4DNA聚合酶•T4DNA聚合酶用途4、逆转录酶TaqDNA聚合酶1.特点：分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75℃，对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3’→5’外切酶活性2.用途DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA分子因而可被扩增4×106倍DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应，包括以下三个步骤：DNA模板变性(95℃)→与DNA引物退火(45℃)→引物延伸(72℃)TaqPol和PCR5’3’变性3’5’5’3’引物3’5’复性5’3’5’3’3’5’引物3’5’5’3’延伸5’3’3’5’3’5’第五节核酸修饰酶第六节单链DNA内切酶•基因突变