第二章基因工程与食品产业

第二章基因工程与食品产业基本内容：基因工程的定义，操作流程，基因工程中常用的工具酶，基因工程载体，基因工程操作方法，基因工程在食品产业中的应用。重点与难点：基因工程的定义，基因工程中常用的工具酶，基因工程载体，基因工程操作方法。当代人类社会所面临的人口的增加、食品的短缺、资源的匾乏、环境污染的加剧、疑难病的诊断和治疗等重大问题，都在不同程度上依赖于生物技术的发展和应用加以解决。第一节基因工程概述1.1基因工程研究意义以基因工程为核心的生物技术已经成为世界高技术革命浪潮的重要组成部分，它可以打破生物属限进行生物种（属、科、目、门、界）内外基因的重组，遗传信息的转移，是人工定向改变生物遗传性的根本技术。基因工程技术的建立和发展，使得在生物学基础研究领域，可从基因的结构与功能入手，在分子水平上为细胞、组织、器官及个体的生长、发育、分化、进化等理论研究开辟了新途径。医学领域，基因工程为采用基因疗法根治遗传性疾病和肿瘤等奠定了坚实的理论与技术基础，使传统技术难以或不能获得的许多珍贵药品得以大量生产，并实现商品化。动植物生产、食品工业等领域，基因工程已经得到了广泛的应用，并将发挥越来越重要的作用。1.2概念就其本质而言，基因工程是指在分子水平上对基因进行操作，所以一般认为基因工程（GeneEngineering)是指运用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同DNA进行体外切割、连接，构建成重组DNA，再将重组DNA经生物介导或直接导入等转移方法引入受体细胞进行克隆、表达，从而改变生物遗传性以创造生物新种质，或通过大量扩增为人类提供有用产品的技术。1.3基因工程的主要内容（操作步骤）根据一般的操作流程，基因工程的研究内容有：①目的基因获得：运用合适的方法从生物体中分离或通过化学合成法制备；②构建重组DNA：将获得目的基因与合适的载体进行体外连接；③转化：将重组DNA导入受体细胞，以获得转化体；④筛选：筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌体或个体。⑤表达：使目的基因在受体生物细胞中高效表达。与宏观的工程一样，基因工程的操作也需要经过“切”、“接”、“贴”和“检查修复”等过程，只是各种操作的“工具”不同，被操作的对象是肉眼难以直接观察的核酸分子。给基因动手术第二节工具酶基因工程的操作，是依赖于一些重要的酶作为工具来对基因进行切割和拼接等操作，这些酶被称为工具酶(Enzymeoftoo1s）。到目前为止，常用的工具酶有300多种,其种类主要有限制性内切酶、核酸酶、连接酶、聚合酶、碱性磷酸酶、逆转录酶等。2.1限制性内切酶指一类能在特定部位限制性的切割双链DNA分子的内切核酸酶，称为限制性内切酶（RestrictionEnzyme，简称RE）。正是由于限制性内切酶的发现，使得基因工程的第一个试验在1972年首次获得成功。通过这种酶的作用，生物的基因组可以分成许多小的、独立的片段，因而能够从这些片段中分离出目的基因，并可进一步克隆和鉴定它们。2.1.1限制性内切酶的分类根据限制性内切酶的作用和特点，可将限制性内切酶分为三种类型。（见附表）由于Ⅱ型限制性内切酶可在特殊位点切割DNA，产生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段，因此被广泛的应用于基因工程，成为分解和重建DNA的基本工具。我们将着重介绍这类酶的特点和作用。Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶蛋白构成三个不同亚基,是多聚体蛋白质由两个相同亚基组成,是一类分子量较小的单体蛋白两个不同亚基组成酶活辅助因子ATP、Mg2+、S-腺苷蛋氨酸Mg2+ATP、Mg2+切割方式先与双链上未加修饰的识别序列相互作用，然后沿DNA分子移动，在行进相当于1000～5000个核苷酸距离之后随机位置上切割单链DNA其切割位点与其识别位点重叠或在其附近，切割作用特异性强具有独特的识别方式和切割方法，其切割位点一般在距离其识别位点3＇端24～26bp处使用不能专门切割DNA某些特殊位点，未在基因工程中大量使用具有特异性切割位点，广泛使用，理想的基因工程酶不常用举例EcoAⅠ、EcoBⅠ等EcoRⅠ、HindⅢ等EcopⅠ、HindⅢ等限制性内切酶的类型及基本特性附表：限制性内切酶的类型及基本特性2.1.2Ⅱ型限制性内切酶的命名、作用特点及用途目前已经从各种不同的细菌中分离出了数百种Ⅱ型限制性内切酶，这些酶的命名方式与一般酶的命名不同。命名原则：用具有某种限制性内切酶的细菌学名缩写来命名，即：以属名的第一个字母（大写）和种名的最前两个字母（小写）组成的三字母符号为其基本形式。在基本名称后面还应该加上菌株的名称符号；罗马数字用来表示从同一个细菌中分离出来的不同的限制性内切酶。2.1.2.1Ⅱ型限制性内切酶的命名例如，EcoRⅠ中的Eco表示从大肠杆菌（Escherichiacoli）中分离出来的，R代表大肠杆菌的R株，Ⅰ表示从中分离出的第一种限制性内切酶。从流感嗜血菌（Hacmophilusinflucnzac）中菌株d分离出来的3种限制酶，分别为HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ。2.1.2.2Ⅱ型限制性内切酶的作用特点1、能够识别特异核甘酸序列，并在特异部位上水解双链DNA中每一条链上的磷酸二酯键，从而造成双链缺口，切断DNA分子。识别位点一般为4-6个碱基对。对于Ⅱ型限制性内切酶而言，其切割位点一般与其识别序列一致，大多数Ⅱ型限制性内切酶在其识别序列内切割，而有些则在距其识别序列附近一定长度的位置切割DNA。2、这些DNA序列大多呈回文结构。由于DNA是双螺旋结构，识别核苷酸序列只能从5‘-末端向3’-末端读其碱基顺序。因此，在识别序列的两条核苷酸链中碱基排列次序是完全相同的，这种结构称回文结构〔PalindromicStructure)，即正读与反读皆相同，如BamHI3、切割后产生粘性末端或平齐末端。限制性内切酶错位切割DNA双链而形成彼此互补的单链末端，称为粘性末端(Cohesionends）。例如，EcoRI的切割形成具有互补碱基序列的单链粘性末端一GAATTC。另一种是在同一位点平齐切割DNA两条链而形成的双链末端，称为平整末端(Flushends）。如Alul的识别序列为：4、切割后产物形成异源二聚体。识别序列不同的限制性内切酶，切割后有可能产生相同的粘性末端。例如BamHI、BglⅡ、MboⅠ这三种不同来源的限制性内切酶的识别序列是不同的，分别为：GGATCC、AGATCC和GATC但它们切割后都产生相同的5’一GATC粘性末端。这类酶的DNA酶解片断都可在体外重组，在连接酶的作用下，可以得到嵌合DNA，称为异源二聚体。这种二聚体不再能被原来两种限制性内切酶所识别，有利于得到大量的重组DNA分子，在基因工程中也显得重要。2.1.2.3用途在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性内切酶切割的DNA片段；建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱；构建基因文库；用限制性内切酶切出相同的黏性末端，以便重组DNA。2.2DNA聚合酶DNA聚合酶（DNApolymerase）：催化DNA体内或体外合成反应的酶。在DNA复制过程中起着重要的作用，其作用时一般都需要模板，合成的产物序列与模板互补。大多数聚合酶优先选用DNA模板，虽然也可以RNA为模板，但后者一般效率较低。DNA聚合酶通常被分为DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类，DNA聚合酶Ⅰ是基因工程中最常用的工具酶。基因工程中常用的DNA聚合酶有：大肠杆菌聚合酶Ⅰ（全酶）大肠杆菌聚合酶I大片段（Klenow片段）T4噬菌体DNA聚合酶；耐热DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）T7噬菌体聚合酶及经修饰的T7噬菌体聚合酶（测序酶）末端转移酶（末端脱氧核苷酸转移酶，也属DNA聚合酶）此处详细讲解TaqDNA聚合酶。TaqDNA聚合酶该酶最初来源于嗜热的水生菌Thermusaquaticus，相对分子质量为65000D,是一种非常耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶。现在可以用基因工程技术生产并应用。该酶主要具有一种活性，即5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物。用途：对DNA进行测序通过聚合酶链式反应（PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增Taq和其衍生物具有依赖于聚合作用的5’→3’外切核酸酶活性。对核苷酸的掺入反应而言，该酶的具体作用温度取决于靶序列。最佳作用温度为75～80℃，于60℃时聚合酶活性仅剩1/2；于37℃时活性仅剩1/10。应用时需要在低于最适温度的条件下起始聚合反应，以免引物从模板链上解离。该酶作用时需要Mg2+，同时，引物—模板杂交体的变性解链和复性温度均受二价阳离子的影响。因此，必须注意每次扩增反应的最佳Mg2+浓度。磷酸盐缓冲液抑制该酶活性，扩增反应通常在Tris缓冲液中进行。应用注意事项：2.3DNA连接酶能将两段DNA拼接起来的酶叫DNA连接酶（Ligase）。该酶催化DNA相邻的5’-磷酸基和3’-羟基末端之间形成磷酸二醋键，将DNA单链缺口封合起来。大肠杆菌和动植物细胞中都有DNA连接酶，基因工程中，最常见的DNA连接酶为T4噬菌体DNA连接酶。T4噬菌体DNA连接酶该酶来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，是相对分子质量为68000D的多肽。在连接反应中多以ATP为辅助因子。该酶具有一种活性，即催化DNA的5’-磷酸基和3’-羟基之间形成磷酸二酯键。底物可以是黏性末端，也可以是平齐末端。用途：连接带匹配黏性末端的DNA分子；由于PEG可以增强水溶液中大分子之间的有效作用，因此，该类试剂在低浓度下可促进DNA分子间的连接。使平齐末端的双链DNA分子互相连接或合成接头相连接，但该类反应要比黏性末端连接慢的多。单价阳离子（例如NaCl，150～200mmol/L）及低浓度的PEG可以大大增加高浓度的带5’-磷酸基和3’-羟基的平齐末端的连接速率。注意事项：该酶不受dNTP抑制，在所有限制性酶缓冲液中均能较好的发挥作用。虽然该酶可作用于DNA底物，也可作用于RNA底物，但其效率要低的多。在连接前，如果DNA缺乏所需的磷酸基团，那么可以用T4噬菌体多核苷酸激酶处理，使DNA磷酸化；相反用磷酸酶除去5’-磷酸基团后，DNA便不再能连接起来。2.4碱性磷酸酯酶基因工程中能催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP的5’-磷酸基，产生5’-羟基末端的酶。基因工程中得到广泛使用的碱性磷酸酶有两种：一种是从大肠杆菌提取的,即细菌碱性磷酸酶（BAP);另一种是从牛小肠提取的，即牛小肠碱性磷酸酶（CIP）。两种碱性磷酸酶反应均需Zn2+。BAP耐热，而CIP在70℃加热10min或经酚抽提则灭活；CIP的特异活性较BAP高10一20倍，因此，CIP应用更广泛。用途：DNA序列分析时，在用32p标记5’-末端前，去除DNA或RNA分子的5’-磷酸基团。去除DNA片段5’-磷酸，以防止自身环化。2.5S1核酸酶S1核酸酶来源于米曲霉（Aspergillsuoryzae)。主要具有一种活性：单链特异性核酸酶活性。特异降解单链DNA或RNA，产物为带5’-磷酸的单链核苷酸或寡核苷酸。双链DNA、双链RNA和DNA—RNA杂交分子对Sl核酸酶不敏感，具有较大的抵抗力，只有高浓度的酶才可使其消化。如果所采用的Sl核酸酶使用量中等，那么可以在切刻或小缺口处切割双链核酸。用途：分析RNA—DNA杂交体的结构。例如：Sl核酸酶保护分析法是一种检测RNA的杂交技术。将单链DNA探针与待测RNA样品在液相中进行杂交，形成RNA—DNA杂交双链，该酶可特异降解未形成杂交双链的DNA单链和RNA单链，而RNA—DNA杂交双链则受到保护而不被降解。去除双链DNA片段中突出的单链尾巴，产生平齐末端。酶解双链cDNA中产生的发夹环。2.6逆转录酶又称依赖RNA的DNA聚合酶。该酶催化以单链RNA为模板生成双链DNA的反应。由于这一反应中遗传信息的流动方向正好与绝大多数生物转录生成方向（即以DNA为模板转录生成RNA的方向）相反，所以此反应称为逆转录作用。常用的逆转录酶有两种：一种来自禽成髓细胞瘤病毒（AMV），由两条多肽链组成，分子量为17