解脂耶氏酵母异柠檬酸脱氢酶基因的克隆与表达

1大肠杆菌苹果酸脱氢酶的原核表达、纯化与酶活力测定摘要：苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase,MDH)普遍存在动物、植物、细菌等多种生物体中，负责催化苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换，在细胞的多种生理活动中发挥重要作用，如C4循环、光合作用、TCA循环。本实验从实验室保存的DH5α重组菌中提取pET28b-mdh重组质粒，并对其进行双酶切鉴定。将重组质粒pET28b-mdh转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中，通过卡那霉素和氯霉素抗性进行筛选。挑取单菌落培养至菌体浓度OD600≈0.6时，用0.1mM的IPTG诱导表达MDH蛋白，然后收集、纯化MDH蛋白并分析其酶活力。结果表明，MDH在大肠杆菌中获得了高量表达，MDH还原草酰乙酸的活力为194.75U/mg。关键词：苹果酸脱氢酶；原核表达；活力测定ExpressionandPurificationofMalateDehydrogenasefromEscherichiacolianditsActivityDeterminationAbstract:MalateDehydrogenaseisubiquitousinanimals,plants,andbacterias,whichcatalyzedtheinterconversionofoxaloacetateandmalatelinkedtotheoxidation/reductionofdinucleotidecoenzymes,whichplayakeyroleinmanymetabolicpathwayssuchasTCAcycle,photosynthesis,C4cycleandsoon.Inthisstudy,weextractedpET28b-mdhrecombinantplasmidfromDH5α,whichwaspreservedinourlaboratory,andexaminedtherecombinantplasmidcorrectnessthroughdoubleenzymesdigestionreaction.ThenwetransformedtherecombinantplasmidintoE.coliRosetta(DE3)andscreenedthepositiverecombinantstrainthoughtkalamycinandchloromycetinresistance.AndthenweculturedtheindividualcolonyuntilOD600≈0.6,thenaddedIPTGtothefinallyconcentration0.1mMtoinducetheexpressionofMDH.WecollectedandpurifiedtheMDHandthenanalyzedMDHenzymeactivity.TheresultshowedthatMDHcanbehighlyinducedtoexpressinE.colianditsactivitytoreduceoxaloacetateis194.75U/mg.Keywords:malatedehydrogenase;prokaryoticexpression;activityassay21前言1.1苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase,MDH;EC1.1.1.37)普遍存在于动物、植物和细菌等各种生物体中，是生物体糖代谢的关键酶之一。根据不同的辅酶特异性，MDHs分为NAD-依赖性的MDHs和NADP-依赖性MDHs.细菌中通常只含有NAD-MDHs，存在于细胞膜上。在真核细胞中，NAD-MDHs分布于细胞质和线粒体中，NADP-MDHs位于叶绿体。NAD-MDHs一般不受代谢调节，NADP-MDHs间接受光调节[1]。MDHs为同源二聚体或四聚体，目前发现的真核生物MDHs都是二聚体，如猪心cyMDH和大米的cyMDH。大肠杆菌的MDH都是二聚体，但芽孢杆菌类类多为四聚体，如枯草杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的MDH。NAD-MDHs亚基分子量在32~37kDa之间，NADP-MDHs亚基分子量约42kDa[2]。MDH能催化苹果酸和草酰乙酸之间的转化：malate+NAD+oxaloacetate+NADH+H+该反应在三羧酸循环、光合作用和C4循环等途径中都有重要作用。1.2苹果酸脱氢酶的研究意义在酸性土壤中铝毒是许多作物正常生产的主要限制因子,虽可通过施用生石灰来改良土壤酸碱度但只能改善土壤表层,在实际应用中受到很大限制。紫花苜蓿作为一种非常重要的牧草饲料在酸性土壤条件下苜蓿生长缓慢甚至死亡[3]。研究表明，有机酸如柠檬酸盐、草酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、丙二酸、琥珀酸盐和醋酸盐[4]可以螯合土壤中的铝离子，降低铝对植物体的毒害作用[5]。这些有机酸中，苹果酸是植物体内关键的代谢物。苹果酸含量提高的途径主要来自植物体合成的提高。MDH可以催化草酰乙酸的氧化作用已形成苹果酸盐，增加植物体内苹果酸的含量，从而显著提高植物体的耐酸、耐铝性。同时MDH的应用研究也将会推动MDHs转基因植物及手性药物的进一步发展。1.3苹果酸脱氢酶的研究进展目前，人们已从原核生物、真核生物、真菌、植物哺乳动物等生物体内均分离提到纯化的MDHs[6]。对于植物苹果酸脱氢酶，根据辅酶特异性，亚细胞定位和生理功能，植物苹果酸脱氢酶可以分为5类：NADP-依赖的叶绿体MDH、NAD-依赖的线粒体MDH、NAD-依赖的微体MDH，NAD-依赖的叶绿体MDH和NAD-依赖的细胞质MDH。叶绿体、线粒体和微体的MDH已被广泛研究，而cyMDH目前研究较少[8]。近些年来由于MDHs的工业应用价值，其受关注的程度日益上升。对其生理生化、分子遗传与进化进行研究已颇为深入。如目前已从水稻、玉米种筛选出苹果酸脱氢酶基因，并对其进行克隆、表达以及生物活性的研究，其中有相当一部分是关于西方蜜蜂苹果酸脱氢酶基因与配合力及杂种优势的研究，也有关于动植物的发育期间苹果酸脱氢酶的分析[9,10]。2材料与方法2.1菌株3DH5α/pET28b-mdh，Rosetta(DE3)均为实验室保存。2.2培养基的配制LB液体培养基(50ml)：Peptone0.5gYeastextract0.25gNaCl0.5gNaOH(1mol/L)50µlLB固体培养基(50ml)：Peptone0.5gYeastextract0.25gNaCl0.5gNaOH(1mol/L)50µlAgar0.75g在清洗干净的250ml锥形瓶中加入50ml的超纯水，再将上面各种物质加入瓶中，振荡摇匀后用纱布和牛皮纸及线绳将瓶口包扎起来，放入高压真气灭菌锅里进行灭菌(121℃，21min)。(灭菌结束前十分钟左右将超净工作台的紫外灯打开灭菌，接下来的操作在超净工作台中进行)待LB固体培养基冷却到40~50℃左右，加入50μL的30mg/ml的Kan，和50μL的25mg/ml的Cam，使其终浓度分别达到30μg/ml和25μg/ml.然后倒平板，冷却凝固。第二天早上将DH5α/pET28b-mdh的菌株接种到培养皿上。2.3质粒的提取1)用接种环挑取保存好的菌种划线37℃过夜培养，菌体长势良好。第二天挑取单菌落于试管中过夜摇菌。2)将夜培养的1-2ml细菌12000rpm离心15s，彻底去除上清。3)加入SolutionⅠ100µl，用枪头或震荡器充分悬浮细菌(悬浮不充分，裂解不完全)；4)加入SolutionⅡ200µl，立即温和混匀(倾斜45度角，顺一个方向慢慢旋转离心管)，使细菌裂解，室温放置2min；5)加入SolutionⅢ350µl立即上下颠倒5-10次使之充分中和，室温放置2min；6)4℃,12000rpm，离心5min，留上清；7)将步骤5中得到的上清移到套放于2.0ml收集管内的UNIQ-10柱中，8000rpm室温离心15s；8)弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，吸500µlwashsolution到UNIQ-10柱中，4℃,10000rpm室温离心30s；9)重复步骤7一次；10)弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，10000rpm室温离心30s，以彻底去除washsolution;11)将UNIQ-10柱放入新的洁净的1.5ml离心管中，加50µlElutionBuffer室温放置2min后，10000rpm室温离心1min，离心管中的溶液即为所提取的4质粒DNA；2.4重组质粒鉴定与转化2.4.1双酶切鉴定重组质粒双酶切反应体系：pET28b-mdhNdeIXhoI10×tangobuffer20µl2µl2µl6µ137℃酶切4小时2.4.2琼脂糖凝胶电泳1)称取0.2g琼脂糖，置于50ml锥形瓶中，加入20ml1×TAE，加热使其全部溶解；2)稍冷后加入1.5µlEB溶液，混合均匀，铺板，安放梳子；3)琼脂糖凝胶凝固后，拔去梳子，放入电泳槽中；倒入1×TAE，淹没胶面；4)用移液枪吸取适量的DNA样品加于点样孔中；5)110V恒压电泳，待溴酚蓝电泳至凝胶边缘还有1cm左右时，停止电泳，紫外灯下观察并拍照。2.4.3感受态细胞的制备1)用接种环挑取保存好的菌种划线过夜培养，第二天于5ml液体培养基中接种Rosetta(DE3)单菌落，37℃振荡过夜培养。2)取1ml过夜培养物接种到50mlLB(Kan,Cam)液体培养基中，37℃药瓶培养2-3h至对数生长期(OD550≈0.350);3)将培养液分装到30个EP管中，冰浴10-15min(每管1.5ml菌液)。4)于4℃，4000rpm离心10min,弃上清。5)三管合一，第一管加1ml冰预冷的CaCl2,混匀，加入第2管，如此将三管合并，冰浴30min。6)于4℃，4000rpm离心8min,弃上清。7)菌体用200µl/ep,0.1mlCaCl2/20%甘油保存，立即用于转化或-80℃保存(最好在-80℃下过夜后再转化)。2.4.4转化1)从80℃冰箱中取出一管100μl的Rosetta(DE3)感受态细胞，冰上复苏10min(冰水浴)；2)将2μl的重组质粒加入到100μl复苏的感受态细胞悬液中，充分混匀，冰浴30min;3)42℃热休克90s;4)立即水浴5min,加500-600μlLB培养液(不加抗性)，37℃轻微震荡1h左右；5)取50μl左右涂布于Kan和Cam筛选平板上，放入37℃恒温培养箱中，5先正面向上放置半小时待菌液完全被吸收后，再将平板倒置培养16-24h；2.5MDH诱导表达1)预培养：挑取转化平板上的单菌落到5mlLB(Kan,Cam)液体培养基中过夜培养；2)将试管中过夜培养的菌液转接1ml于50mlLB(Kan,Cam)的锥形瓶中扩大培养,37℃培养2-3h至OD600=0.6；3)向锥形瓶中加入5μl1mol/LIPTG，使其终浓度达到0.1mM/L。37℃诱导表达6-8小时。4)提前将冷冻离心机打开使之降温到4℃,将诱导表达后的菌液倒入50ml的已经灭过菌的离心管中，配平后，在4℃下5000rmp离心6min,用5ml的LEWbuffer洗涤两遍后，菌体保存在-80℃冰箱中，等待破碎。2.6菌体破碎与蛋白纯化1)将-80℃保存的菌体取出放入冰中解冻10min，加入10ml的LEWbuffer(Lysis/Equilibrium/Washingbuffer)混匀悬浮菌体，转入15ml的已经灭过菌的塑料离心管中进行破碎。2)使用超声波破碎仪进行细胞破碎。破碎1s，暂停2s，全程破碎时间21min。破碎过程注意用冰水浴降温。3)4℃，10000rmp离心20min，收集上清，弃沉淀，用于纯化。4)纯化a.平衡树脂：用4ml的LEWbuffer平衡再生过后的纯化柱中的树脂。b.蛋白质的结合：将破碎液离心收集的上清液加入到柱中进行过滤。c.洗柱：用10mlLEWbuffer洗柱子，目的是洗去