第二章基因工程工具酶(简化版)

第二章基因工程的工具酶一、限制性核酸内切酶的发现第一节限制性核酸内切酶限制(restriction)修饰(modification)限制性核酸内切酶的生物学功能：自我保护功能(只切外来的DNA，自身DNA被甲基化后切不动)核酸酶：水解断裂多核苷酸链的两个相邻核苷酸的3,5磷酸二酯键核糖核酸酶（RNase）：脱氧核糖核酸酶（DNase）：核酸外切酶（exonuclease）：核酸内切酶（endonuclease）：限制性核酸内切酶：二、限制性核酸内切酶的分类主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM识别序列特异性非对称性序列特异性4-8bp旋转对称序列特异性非对称性序列切割位点距识别序列1kb处随机性切割识别序列内或附近特异性切割距识别序列下游24-26bp用途无应用价值应用广泛无应用价值平末端粘性末端1单位酶活性(1unit1U)：在最适反应条件下1小时完全切割1ugλDNA样品的酶量。同序同裂酶(识别及酶切位点相同):同序异裂酶(识别位点相同但酶切位点不同):同尾酶(酶切位点不同但产生相同的粘性末端):酶切位点的计算：四核苷酸识别序列：44=256六核苷酸识别序列：46=40962个假设：a随机排列；bGC含量50%如：用BglⅡ(A/GATC/T)酶切λDNA49Kb）:理论上的切点数：49000/4096=12个实际情况？三、限制性核酸内切酶的命名1973年H.Smith和D.Nathans提议①每一种酶都由产生并纯化生出该酶的细菌的种属名中的三个英文字母合起来代表：第一个字母采用细菌属名的第一个字母大写；第二和第三个字母小写，采用细菌种名的前两个字母；如大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示，代表从大肠杆菌中分离出的限制性内切酶。②第四个字母表示菌株的类型（大小写均有），如EcoR中的R代表大肠杆菌R株。③如果一个菌株有几种限制酶，则在代表菌株的字母后用罗马数字表示。思考题：流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）d菌株有三种限制酶，分别怎么表示？HindI、HindII、HindIIIBaciUusamyloliquefaciensHStreptomycesalbusI一、天然DNA的制备1、天然DNA的来源①染色体DNA②病毒和噬菌体DNA③质粒DNA④线粒体和叶绿体DNA第二节DNA分子片段化2、天然DNA的提取①准备生物材料。②裂解细胞。③分离和抽提DNA。二、DNA的纯化琼脂糖凝胶电泳洗脱法适用于小剂量DNA的纯化和酶切DNA片段的回收。三、DNA的浓缩乙醇沉淀法在含一价阳离子的DNA溶液中加入2体积的无水乙醇，使DNA沉淀（-20℃，时间在30min以上）通过离心收集沉淀的DNA溶于适量的TE缓冲液或无菌水中四、限制性核酸内切酶反应1、限制性核酸内切酶反应缓冲液2、单酶切法若DNA样品是环状DNA分子，完全酶切后，产生与识别序列数（n）相同的DNA片段数，并且DNA片段的两末端相同若DNA样品本来就是线形DNA片段，完全酶切的结果，产生n＋1个DNA片段数，其中有两个片段的一端仍保留原来的末端3、双酶切法应先用需要较低盐浓度缓冲液的酶进行切割，然后调节缓冲液的盐浓度，再加入需要较高盐浓度缓冲液的酶进行切割。如果两种限制性核酸内切酶的最适反应温度不同，则应先用最适反应温度较低的酶进行切割，升温后再加入第二种酶进行切割。若两种限制性核酸内切酶的反应系统相差很大，会明显影响双酶切结果，则可以在第一种酶切割后，经过凝胶电泳回收需要的DNA片段，再选用合适的反应系统，进行第二种限制性核酸内切酶的切割。4、部分酶切当某种限制性核酸内切酶在待切割的DNA分子上有多个识别序列，并且其中一个识别序列正好在切割后需要回收待用的DNA片段上，若完全酶切，势必将此待用的DNA片段从中切断。在此情况下，对DNA样品进行部分酶切，经过凝胶电泳，根据待用DNA片段的大小，可回收待用的DNA片段5、DNA分子的限制性图谱五、影响核酸内切限制酶活性的因素（1）DNA的纯度（2）DNA的甲基化程度（3）酶切消化反应的温度（4）DNA的分子结构（5）星星活性第三节DNA聚合酶间断(discontinuity)：在DNA的一条链上某一位置两个相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂。缺刻(nick)：某一位置上丢失了一个或几个核苷酸。（1）以DNA聚合酶I为代表的“合成型”（2）以klenow聚合酶为代表，只有聚合酶活性和部分外切酶的活性（3）逆转录酶类，以RNA作为聚合模板根据模板和作用方式的不同分为三类：二、大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）1、性质:①5’→3’DNA聚合酶活性②3’→5’外切核酸酶活性③5’→3’外切核酸酶活性三、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）1、性质它具有5’→3’聚合活性和3’→5’外切酶活性,失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性.四、T4噬菌体DNA聚合酶1、性质具有5’→3’聚合酶活性及3’→5’外切核酸酶活性。其3’→5’外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA的作用更强。它的外切核酸酶活性比kenow片段要强200倍。2、用途1）补平或标记限制性内切酶消化DNA后产生的3’凹端。2）对带有3’突出端的DNA分子进行末端标记。五、T7噬菌体DNA聚合酶1、性质持续合成能力最强3’→5’外切核酸酶活性为klenow片段的1000倍没有5’→3’外切酶活性。2、主要用途1）用于拷贝长段模板的引物延伸反应。2）通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记。六、TaqDNA聚合酶具有5’→3’外切核酸酶活性。最佳作用温度为75-80℃。无3’→5’外切核酸酶活性，纠错功能较差。用途1）可使特定序列扩增106倍。2）用于聚合酶链式反应（PCR），对DNA片段进行体外扩增。七、逆转录酶（reversetranscriptase）依赖于RNA的DNA聚合酶商品化逆转录酶：①禽源反转录酶（AMV），②鼠源反转录酶（Mo—MLV）反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链第四节PCR反应及应用PCR（PolymeraseChainReaction）称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。具有特异性强、灵敏度高、简便快速、对标本的纯度要求低等特点。变性94˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C基本反应步骤PCR技术的特点高特异性高灵敏度简便快速低纯度标本也可使用第五节DNA连接酶（ligase）DNA连接酶：将两个DNA片段通过催化形成3’，5’－磷酸二酯键而连接起来的酶。T4DNA连接酶：可连接DNA链（平粘端均可），也可连RNA链，应用广泛。E.coliDNA连接酶：平端连接效率远低于T4DNA连接酶，不能连接RNA分子。T4RNA连接酶：可催化两个单链DNA或RNA分子的连接。一、连接酶功能1、间断修复功能2、连接功能三、粘性末端连接技术1、衔接体(linker)技术2、结合体(adaptor)技术3、同聚体(homopolymer)加尾技术第六节结合体技术的应用—AFLPAFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism）•AFLP一词是1991年Gustavo提出的;•该方法结合了RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)技术和RAPD技术的特点;•使用人工接头（Adaptor）与限制性内切酶酶切的基因组DNA片段连接并以此为DNA模板，合成系列3`—末端随机变化数个碱基且与人工接头序列相互补的PCR引物，来进行PCR特异条带扩增，经电泳检测后可获得DNA指纹图谱。此项技术优点（1）稳定，重复性好；（2）需用的DNA量少，适用于分析的DNA大小范围宽；（3）能产生更多的多态性标志，得到的条带也更密集，一般比RFLP和RAPD多10～100倍，便于比较分析；（4）操作易于标准化和自动化，适于大批量的样品分析。第七节基因工程的其它酶类一、DNA及RNA的修饰酶（一）未端（脱氧核苷酸）转移酶（二）碱性磷酸酶(alkalinephosphatase）（三）多核苷酸激酶(polynucleotidekinase)二、单链核酸内切酶（一）S1核酸酶（二）Bal31核酸酶核酸外切酶底物切割位点大肠杆菌核酸外切酶ⅠssDNA5’—OH末端大肠杆菌核酸外切酶ⅢdsDNA3’—OH末端大肠杆菌核酸外切酶ⅤDNA3’—OH末端大肠杆菌核酸外切酶ⅦssDNA3’末端，5’P末端λ噬菌体λ核酸外切酶dsDNA5’P末端T7噬菌体核酸外切酶dsDNA5’P末端三、核酸外切酶(exonucleases)本章复习要点•限制性内切酶三种类型酶及各自特征；II型酶的相关概念；酶切位点的估算；酶切反应。•DNA聚合酶DNA聚合酶I、Klenow酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、反转录酶及Taq酶各自的作用特点及用途；PCR的作用原理及几种延伸技术。•DNA连接酶T4DNA连接酶的作用特点；衔接体、人工接头及同聚物加尾三种技术的原理；AFLP技术的原理。•其它工具酶末端转移酶、磷酸酶及T4多聚核苷酸激酶的特点及用途。