第五章 植物基因工程

第五章植物基因工程第一节高等植物的遗传学特征一、植物的基本特征二、遗传操作的简易性•大多数高等植物具有自我受精的遗传特征，通常能产生大量的后代；而且借助于如风、重力、昆虫传播等自然条件，受精范围广、速度快、速率高。因此，即便是频率极低的基因突变和重组实际，其遗传后果也易被观察。三、整株植物的再生性•植物损伤后，会在伤口长出一块软组织，称为愈伤组织。如果将一小片鲜嫩的愈伤组织取下，则这些细胞便会持续生长并分裂成悬浮液。将这些细胞涂在特定的固体培养基上，就会长成新的幼芽，并且这些愈伤组织重新分化成叶、根、茎，最终成为整株开花植物。愈伤组织的细胞分化取决于植物生长素和分裂素的相对浓度。生长素与分裂素之比高，则根部发育；植物细胞通常不能有效地吸收外源DNA，因为它们具有纤维素构成的细胞壁。可用纤维素酶处理植物细胞壁，形成原生质体，待吸收DNA分子后，经过再生，再通过愈伤组织形成培育出整株植物。这项技术有一定的局限性，即大多数单子叶农作物（如谷类作物）很难从原生质再生出完整细胞。•如粳稻只有少数品种如台北309等，可由原生质体再生植株，大多数优良的粳稻品种和绝大多数籼稻品种都难以由原生质体再生。可用原生质体再生植株的籼稻品种至今没有获得转基因植株。四、染色体的多倍型•很多高等植物拥有比人类更大的基因组，并以多倍体的形式存在。大约三分之二的禾本科植物呈多倍体型，其染色体数目范围从24到144不等。这种多倍体植物在组织培养过程中呈现出较高的遗传不稳定性，导致体细胞变异。第二节高等植物基因工程的基本概念1.植物基因工程的定义：利用基因工程技术，在离体条件下对生物的DNA进行加工，并按照人们的意愿和适当的载体重新组合，再将重组DNA转入植物体或细胞内，并使其在植物细胞中表达，从而生产不同的产物或定向创造生物的新性状，并能稳定的遗传给下代。2.转基因植物的特点：高产优质抗逆性：抗病虫、抗严寒、抗高温、抗盐碱、抗倒伏、抗除草剂植物基因工程的基本路线（1）目的基因的分离（2）将目的基因克隆到适当的载体（表达载体）形成重组DNA，载体上有启动子和终止子，还连接一个编码特殊蛋白质（如荧光蛋白）的标记基因（3）利用细菌繁殖扩增重组DNA（4）利用基因枪、农杆菌等方法将重组DNA导入目标植物的细胞中。（5）筛选含有外源基因的转化细胞，并诱导产生转基因植株。（6）大规模种植转基因植物。3.植物转化受体系统的类型及其特性•植物基因转化受体系统的条件•高效稳定的再生能力•较高的遗传稳定性•具有稳定的外植体来源•对选择抗生素敏感•对农杆菌侵染有敏感性•3.1愈伤组织再生系统•愈伤组织再生系统是指外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并通过分化培养获得再生植株的受体系统•用叶片、幼茎、子叶、胚轴等为外植体。特点：⑴外植体细胞经历脱分化和再分化两个过程⑵扩繁量大⑶外植体试材广泛⑷该再生系统获得的再生植株无性系变异较大，转化的外源基因遗传稳定性较差⑸该再生系统几乎适用于每一种通过离体培养途径能再生植株的植物⑹嵌合体多3.2直接分化再生系统所谓直接分化再生系统是指外植体细胞越过脱分化产生愈伤组织阶段而直接分化出不定芽获得再生植株。用叶片、幼茎、子叶、胚轴等为外植体。特点：⑴获得再生植株的周期短，操作简单。⑵体细胞无性系变异小。⑶较多的嵌合体⑷转化频率低于愈伤组织再生系统•3.3原生质体再生系统•特点：•⑴原生质体被除去了细胞壁这一天然屏障，能够直接高效的摄取外源DNA或遗传物质，甚至细胞核。•⑵通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞克隆，嵌合体少。•⑶原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定的同等控制条件下进行准确的转化和鉴定。•⑷原生质体培养用期长、难度大、再生频率低。•⑸遗传变异大，遗传稳定性更差。•3.4胚状体再生系统•植物体细胞胚胎发生是指二倍体或单倍体细胞在未经性细胞融合的情况下，模拟有性合子胚胎发生的各个阶段而发育形成的一个新的个体的形态发生过程。•经体细胞胚发生而形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构，称之为体细胞胚或胚状体。特点：⑴胚状体是由具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来，这些胚性细胞具有很强的接受外源DNA的功能转化率和转化效率均高。⑵多数单细胞起源，嵌合体少。⑶胚状体具有两极性，即在发育过程中同时可分化出芽和根形成完整植株，这样减少了不定芽发育途径中比较困难的一个环节——生根培养。⑷利用转基因的胚状体可以生产人工种子。⑸体细胞胚成苗快、数量大有利于生产和推广。3.5生殖细胞受体系统利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统称之为生殖细胞受体系统，也称之为种质系统。两个途径利用生殖细胞进行基因转化：一、利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织，进一步分化发育成单倍体植株，以此为受体进行转化。二、直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化。特点：⑴有更强的接收外源DNA的能力。⑵能使转基因充分表达，而且通过加倍后即可成为纯合二倍体，加速纯化过程。⑶利用植物自身的授粉过程操作方便。⑷利用该受体系统进行转化受到季节的限制。无性繁殖的植物不宜采用。4植物表达载体的组成特点•植物基因表达载体的主要功能是在受体细胞中表达外源基因（大多数是以Ti质粒为基础构建的）：启动子、终止子、T-DNA序列、内含子序列、选择标记基因和报告基因启动子：按其功能分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子组成型启动子：外源基因在其调控下，表达大体恒定在一定水平，在不同组织部位没有明显差异，没有时空特异性。如：Ti质粒的胭脂碱合成酶基因（nos）启动子。诱导型启动子：在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可大幅度提高外源基因的表达水平。如：光、热和创伤诱导启动子等。•组织特异性启动子：该启动子控制的基因只发生在特定器官或组织部位，并表现出受发育过程调控的特性。典型例子如：马铃薯块茎蛋白基因启动子，只在块茎中表达。•终止子：TGA和TAA•不同来源的终止子对外源基因的表达有很大的影响，它不仅决定外源基因的转录活性，也决定mRNA在细胞中的稳定性，从而影响mRNA的翻译。•T-DNA序列：构建表达载体的一个关键元件•T-DNA序列进入受体植物细胞后有两种命运：•内含子序列•真核基因常被一个或数个内含子分隔，转录后的前提mRNA经剪切后变为成熟的mRNA.•研究表明内含子与基因表达有很大关系，它促进基因的表达是通过增强活性mRNA含量，从而有利于基因的表达。所以构建基因表达载体时，可根据不同基因类型，有选择的插入内含子序列。•选择标记基因和报告基因•选择标记基因：是在选择压力下将转化体筛选出来，因此它实际上是一种未转化细胞的抑制剂，但它对转化细胞的生长和分化不影响。•报告基因：报告和识别作用，它的表达产物对植物无毒性，它反映外源基因在植物细胞中的翻译水平。如：细菌和萤火虫的荧光素酶；绿色荧光蛋白•转入荧光素酶的烟草提高外源基因在植物细胞中表达效率的策略1.构建高效表达的转化载体•选择合适的启动子（如组织特异性启动子、强启动子）•构建完整的基因表达调控序列-转录和翻译•合理插入内含子-提高外源基因的表达•2.防止外源基因失活•在某些情况下外源基因表现为基因沉默。造成沉默的原因很多。它可能与基因的重复拷贝、DNA甲基化、染色体结构重拍和转录产物的不稳定等有关。•在基因工程中，分离单拷贝的转基因个体，构建含有核基质支架附着区的转化载体，根癌农杆菌TI质粒介导的基因转化1.外植体的选择•选择具有分裂能力（S期）的细胞。•以叶片、子叶、胚轴为首选外植体材料•选择幼年的外植体•以幼胚、体细胞胚及成熟胚作为外植体时应考虑其转化的最佳感受期。•基因转化外植体和组织培养外植体的选择基本一致。•感受态细胞在外植体的部位。2.诱导物的使用方法•诱导物（诱导Vir基因）加入的时间•在农杆菌液体培养时加入诱导剂，加入时间一般在制备工程菌液浸染液使用前4-6小时加入。•诱导物加在农杆菌和外植体共培养的培养基中。3.农杆菌与外植体共培养•接种菌体后的外植体培养在诱导愈伤组织或不定芽分化的固体培养基上，在外植体细胞分裂、生长的同时，农杆菌在外植体切口面也增值生长，该两者共同培养过程称之共培养•最佳共培养的时间•细胞调节期：农杆菌转化时，并不侵入到植物细胞中去，而是把T-DNA转移到植物细胞。农杆菌附着后不能立即转化，只有在创伤部位生存16小时后的菌株才能诱发肿瘤，这一段时间称为细胞调节期•共培养时间必须长于16小时。共培养时间太长，农杆菌过度生长毒害植株而死亡。•确定最佳共培养时间的方法主要用gus基因瞬时表达测定法：共培养后定时测定外植体的gus基因颜色反应，以表达率高，表达面积大为优，以保证外植体的旺盛生长为宜，最后以获得的转化愈伤组织频率或转化不定芽频率为最终依据。