第五章 酶工程

第五章酶工程酶工程定义定义:将酶所具有的生物催化功能,借助工程手段应用于社会生活的一门科学技术；利用酶催化的作用,在一定的生物反应器中,将相应的原料转化为所需要的产品；利用酶、细胞器或细胞的特异催化功能，通过适当的反应器工业化生产人类所需产品或达到某种特殊目的的一门技术科学。(大唐搜索)领域:酶学理论与工程技术相结合而形成的新技术“酶工程”的定义运用酶学知识结合数学和/或其他系统性知识设计有实用价值的新酶(生物催化剂，固定化生物催化剂，生物催化反应体系,生物催化反应器。。。)一门研究如何发挥酶的催化功能的技术科学酶学知识酶是什么？有催化活力的蛋白质蛋白质一般不稳定,反应条件温和催化能力高效性,专一性化学选择性，区域选择性，立体选择性TheMechanismofEnzymeCatalysis酶与过渡态中间物的紧密结合，稳定了底物的过渡态结构，从而降低了底物形成其过渡态所需克服的能垒，提高了反应的速度酶的命名氧、转、水、裂、异、合(连)1.Oxidoreductases氧化还原酶2.Transferases转移酶3.Hydrolases水解酶4.Lyases裂合酶5.Isomerases异构酶6.Ligases连接酶ATP水解偶联国际酶学委员会EnzymeCommission(EC)酶知识复习小结酶是有催化活力的蛋白质酶与过渡态中间物的紧密结合，稳定了底物的过渡态结构，从而降低了底物形成其过渡态所需克服的能垒，提高了反应的速度酶分为6大类，酶的命名可以在上查询酶的生产方法重组表达系统酶的分离提取酶的固定化技术酶反应器酶工程的历史酶的历史在麦芽中发现淀粉酶1833在胃中发现消化酶--胃蛋白酶18361873从小牛胃提取凝乳酶用于制酪Enzyme定名--意为在酵母中1878钥匙-锁理论提出1894以米曲霉生产淀粉酶作为消化酶中间产物学说米氏方程1913获得脲酶结晶酶是蛋白质19261949液体深层发酵生产细菌α-淀粉酶固定化酶1953操纵子学说酶生物合成机制19601969固定化氨基酰化酶生产L-氨基酸1973基因工程技术1978定点突变技术1984TyrRS的蛋白质工程1986重组酶生产1993定向进化1994DNAshuffling酶的生产植物来源来源酶应用刀豆脲酶诊断木瓜木瓜蛋白酶烘焙，制酪，制革，嫩肉粉，啤酒澄清无花果无花果蛋白酶嫩肉粉菠萝菠萝蛋白酶烘焙辣根辣根过氧化物酶诊断柠檬β-糖苷酶科研小麦酯酶酯水解与合成大麦β-淀粉酶烘焙，麦芽糖浆大豆β-淀粉酶烘焙，麦芽糖浆动物来源的工业用酶来源酶工业用途肝过氧化氢酶食品胰腺胰凝乳蛋白酶制革胰腺脂肪酶食品皱胃凝乳酶制酪胰腺胰蛋白酶皮革微生物来源的工业用酶EnzymeECnumberSourceIntra/extra-cellularScaleofproductionIndustrialuseBacterialenzymesa-Amylase3.2.1.1BacillusE+++Starchb-Amylase3.2.1.2BacillusE+StarchAsparaginase3.5.1.1EscherichiacoliI-HealthGlucoseisomerase5.3.1.5BacillusI++FructosesyrupPenicillinamidase3.5.1.11BacillusI-PharmaceuticalProtease3.4.21.14BacillusE+++DetergentPullulanase3.2.1.41KlebsiellaE-StarchFungalenzymesa-Amylase3.2.1.1AspergillusE++BakingAminoacylase3.5.1.14AspergillusI-PharmaceuticalGlucoamylase3.2.1.3AspergillusE+++StarchCatalase1.11.1.6AspergillusI-FoodCellulase3.2.1.4TrichodermaE-WasteDextranase3.2.1.11PenicilliumE-FoodGlucoseoxidase1.1.3.4AspergillusI-FoodLactase3.2.1.23AspergillusE-DairyLipase3.1.1.3RhizopusE-FoodRennet3.4.23.6MucormieheiE++CheesePectinase3.2.1.15AspergillusE++DrinksPectinlyase4.2.2.10AspergillusE-DrinksProtease3.4.23.6AspergillusE+BakingRaffinase3.2.1.22MortierellaI-FoodYeastenzymesInvertase3.2.1.26SaccharomycesI/E-ConfectioneryLactase3.2.1.23KluyveromycesI/E-DairyLipase3.1.1.3CandidaE-FoodRaffinase3.2.1.22SaccharomycesI-Food微生物酶生产率提高的手段菌种选育－－诱变育种发酵工艺优化－－发酵工程重组表达－－基因工程酶制剂使用添加剂共价修饰固定化小结酶的来源很多，但主要来源于微生物发酵酶的工业化应用取决于他们的效果，成本和安全性离心一般用于收集含酶固体过滤更多用于液体酶回收双水相体系将会在酶回收操作中得到更多应用制备工业用酶需尽量压缩分离提取步骤酶制剂必须稳定，使用安全固定化酶优点便于从反应体系中分离从而易于控制反应时间，减少酶失活可反复使用降低用酶成本提高酶稳定性缺点传质限制动力学性质发生变化固定化增加额外成本a.吸附b.共价连接c.包埋d.膜限制酶的固定化方法多点作用使酶稳定化固定化载体EupergitC®Sepabeads®series新型固定化方法—无载体固定化Thedifferentapproachestotheproductionofcarrier-freeimmobilisedenzymes:(a)crystallization;(b)aggregation;(c)spray-drying;(d)directcross-linking.AGG,aggregates;CRY,crystals;SDE,spray-driedenzyme.固定化酶小结酶的固定化使得他们能高效和连续使用酶的固定化形式有4种酶的固定化影响动力学性质酶的固定化一般可提高其使用的经济性酶的固定化新技术－－无载体固定化酶反应器图解小结重组微生物是酶的最重要来源工业用酶的分离提取对成本敏感固定化酶是工业用酶制剂的重要形式酶反应器对于发挥酶的催化作用也很重要酶的改造获得新酶的途径自然界中获取有理设计新酶随机方法筛选新酶生物多样性与新酶的发现嗜热菌（Thermophiles)嗜冷菌（Phyphophiles)嗜酸菌（Acidophiles)嗜碱菌（Alkaliphiles)嗜盐菌（Halophiles)嗜压菌（Barophiles)极端微生物的特殊生长环境及代谢产物，使酶在“恶劣”环境下能够发挥高效催化作用。目前已经有158种微生物的基因组被全测序SαIβDistributionforpenicillinGacylasePGAprecursorstructure天然酶•化学-转化天然底物•物理-耐受差•生物-代谢调控和高转换数•环境不同•要求不同自然进化中天然酶的结构功能对应于其活细胞的生理功能而进化的天然酶往往不适用于生物技术应用改造目的•高专一性只催化所需反应减少甚至没有副产物•高活性高生产率不易受抑制•高稳定性存放时间长操作稳定性高生物催化剂应用依赖于天然酶改造或重新设计方法酶的改造蛋白质工程－－理性设计通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研究获取关于蛋白质物理、化学等方面的信息，在此基础上对编码该蛋白的基因进行有目的的设计改造，并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终将其投入实际应用。基因工程，结构生物学和生物信息学化学修饰固定化定向进化－－非理性设计有理设计根据详尽的结构功能关系知识结构一级结构氨基酸顺序二级结构a-螺旋,b-折叠,转角,无规卷曲三级结构3D折叠(结晶，NMR)功能活性位点氨基酸残基和辅因子催化机理,特异性和动力学调节竞争性抑制和变构控制怎么获得这些信息？经典途径纯化目标酶，分析氨基酸序列分离基因并重组表达结晶目标酶，X射线分析序列与结构分析多重联配序列保守性信息结晶/同源模建获得立体结构三维结构分析分子图像分析有理设计目标催化效率稳定性热稳定性有机溶剂稳定性pH曲线提高热稳定性的重要全局性因素•环区长度减少以及随之而来的二级结构增加•表面电荷相互作用•敏感氨基酸残基减少(如半胱氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺)•芳香环堆积增加•疏水作用增加•金属离子结合能力提高•寡聚增加常用提高稳定性方法引入二硫键和/或盐桥CCOOCCOOCCOOCCOOCCOOIndex1Index2Index3Index40OSP0.150.15OSP0.300.30OSP0.450.45OSP0.600.60OSP0.75FullyexposedstateExposedstateBoundarystateBuriedstateWell-buriedstateIndex5氨基酸残基分布差异高PRO低MET低极显著低低SER（低）低（低）ASN高TYR高TRP低LYS高极显著高GLU高高ARG高ILE低VAL高极显著低极显著ALA完全包埋包埋部分包埋/部分暴露暴露完全暴露对于热稳定性改造的具体指导完全暴露SER,LYSILE暴露ALA,VAL,ASN,SERARG,GLU部分包埋/部分暴露SER?包埋：METARG,GLU完全包埋：?ALA,TRP,TYR,PROpH曲线的改变将蛋白质表面变得更带负电荷将提高酸性基团的pKa值，因为它们在离子化时丢失质子。反之，将表面变得更带正电荷则降低所有酸性基团的pKa值。低离子强度时变化将最大如果避免多电荷抗衡离子，当离子强度高至0.1M时会出现明显的变化。突变设计应避免在活性中心空穴附近聚集抗衡离子。融合蛋白质－－广义的有理设计•组氨酸标签(Histidine-tag,his-tag)•谷胱甘肽合成酶(glutathionesynthetase,GST)•麦芽糖结合蛋白质(maltosebindingprotein,MBP)•内含肽(Intein)•各种信号肽改善重组蛋白可溶性，便于亲和层析纯化。。。生物催化剂的定向进化进化逐步过程自然进化•自发突变•重组•自然选择达尔文进化理论生命的复杂性是突变，重组和自然选择算法的结果人类的作物，花卉和家禽家畜育种实践有几千年历史加速进化快速改变农业进化•自发突变•育种•筛选革命极快改变实验室进化•加快突变速度•分子育种•筛选实验室进化不同于自然进化在于其明确的进化目标.在此意义上它是“定向”并且更像育种。此外，它非常快。加速进化快速改变农业进化•自发突变•育种•筛选革命极快改变实验室进化•加快突变速度•分子育种•筛选进化逐步过程自然进化•自发突变•重组•自然选择定向进化的基本过程SinglegeneDNAshufflingMultiplegenesDNAfamilyshufflingExpressionandscreenRepeatedasneededComparisonofsinglesequenceshufflingversussequencefamilyshuffling高通量筛选－－无理设计的有理部分selec