超氧化物歧化酶SOD提取

1．实验材料：玉米籽粒。2．试剂：注意配好每一试剂时，应立即转入试剂瓶当中，不要将试剂放在容量瓶当中存放，一定要及时将试剂瓶贴好相应的标签，标明溶液的浓度、pH值、体积、试剂名称、配制时间、配制人。配制时一定要标清，使用时注意不要将其弄掉，这一点将给您带来无比的快捷和方便。在未经老师允许的情况下，不要随意倒掉实验室内的任何药品或试剂。（1）1％次氯酸钠：用移液管准确吸取4mL次氯酸钠，置于500mL大烧杯中，再用量筒准确量取400mL自来水稀释该次氯酸钠。（2）提取缓冲液：0.05mol/L磷酸氢二钾—磷酸二氢钾缓冲液，pH7.8。具体配制方法如下：首先是1mol/LpH7.8的磷酸钾缓冲液母液的配制。a.1mol/LKH2PO4溶液：称取13.6gKH2PO4，置于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。b.1mol/LK2HPO4溶液：称取22.8gK2HPO4，置于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，可稍加热，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。c.取5mLa液与55mLb液混合后，调节pH为7.8，该液即为1mol/L的磷酸钾缓冲液母液。d.0.05mol/LpH7.8磷酸钾缓冲液的配制（内含1mmol/LEDTA及0.1%β-巯基乙醇）：称取EDTA·2Na·2H2O0.372g置于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1000mL容量瓶中，用移液管吸取1mLβ-巯基乙醇置入该1000mL容量瓶中，用50mL量筒量取50mLc液至该1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。（3）测试缓冲液：0.026mol/LMet—磷酸钠缓冲液具体配制方法：首先是0.1mol/LpH7.8Na2HPO4—NaH2PO4缓冲液母液的配制。a.称取Na2HPO4·12H2O（MW=358.14）35.814g于100mL小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，移入1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。b.称取NaH2PO4·2H2O（MW=156.01）1.56g于50mL小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。c.量取915mLa液与85mLb液混合后，该液即为0.1mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液母液。d.称取L-Met（MW=149.2）0.1941g于50mL小烧杯中，用少量0.1mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液溶解后，移入50mL容量瓶中，用0.1mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液定容至刻度。（4）7.5×10-4mol/L氯化硝基四氮唑蓝（NBT）称取NBT（MW=817.7）0.0613g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度（最好现用现配，也可贮于冰箱中用2~3d）。（5）2×10-5mol/L核黄素溶液a.称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。b.称取核黄素（MW=376.36）0.0735g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。c.合并a液和b液，移入100mL容量瓶中，并充分用蒸馏水洗净上述a和b两个小烧杯，将洗液移入该容量瓶中，再用蒸馏水定容至刻度（含EDTA0.1mmol，核黄素2mmol）。贮于冰箱中，避光保存。d.测定酶活临用前，将c液稀释100倍，即为2×10-5mol/L核黄素溶液。（6）苯甲酸钠：1瓶。（7）BaCl2：1瓶。（8）（NH4）2SO4：500g/瓶，1瓶/大组。3．仪器：天平3台，胶体磨1台，超滤器（0.5m2）1台，恒温培养箱1台，高速冷冻离心机1台，可见分光光度计5台，光照箱3台，移液管架5个，移液管（10mL，5mL，2mL，1mL，0.5mL，0.2mL各10支），微烧杯（10-15mL）130个，量筒（100mL，50mL，1000mL各3个），容量瓶（100mL，50mL各10个），烧杯（100mL，250mL各5个），125mL棕色试剂瓶12个，125mL白色试剂瓶10个，1000mL白色试剂瓶6个，1000mL棕色试剂瓶5个，纱布等。四、操作方法1．SOD粗提液的制备取200g玉米籽粒用自来水洗净后，用1％次氯酸钠400mL漂洗10min消毒后，然后用自来水彻底洗净，置于器皿中，于28℃恒温培养箱中浸泡吸胀24h后，用自来水洗净，去掉多余的水分，用四层纱布蒙好，置于28℃恒温培养箱中发芽24h后，用自来水洗净，再用蒸馏水润洗一次后，进行扒胚，不要求胚的完整性，将胚置于大研钵中，用0.05mol磷酸氢二钾—磷酸二氢钾提取缓冲液50mL，另外加入1g苯甲酸钠，在研钵中充分研磨，再加0.05mol磷酸氢二钾—磷酸二氢钾提取缓冲液50mL，匀浆，在室温下轻轻搅拌4次/h，浸提1h，8500r/min离心20min，弃沉淀，所得上清液用四层纱布过滤以除去漂浮物，即为酶的粗提液。将上述粗酶液称量总体积后，再留取10mL粗酶液，用于测定盐析前的酶活力及比活力和实验九的电泳。2．SOD浓缩（1）盐析将上述剩余的酶粗提液先以40%（NH4）2SO4饱和1h，8500r/min离心20min去除沉淀，留取上清液，再用90%（NH4）2SO4盐析24h，8500r/min离心40min，弃去上清液，沉淀用0.05mol/LpH7.8磷酸氢二钾—磷酸二氢钾提取缓冲液5mL重溶，以蒸馏水透析过夜。将透析液8500r/mim离心20min后，弃沉淀，留取上清液，并量取其体积，即为酶浓缩液。用于测定透析后的酶活力及比活力与浓缩倍数及回收率，以及用于实验九的电泳。（2）超滤浓缩取酶粗提液经0.5m2超滤器（膜的截留分子量为1万）浓缩后，量取体积，计算酶活力、比活力、浓缩倍数及回收率。3．SOD活性测定表反应体系中各试剂及酶液的取量注：酶液为盐析前的和透析后的两个样品，一个为粗酶液，一个为浓缩液。取8个微烧杯，编好号后，以反应系统总体积为3.0mL计算，按上表加入各试剂及酶液。试剂加入后充分混匀，取1号微烧杯放入暗处作为空白（调零时用）。其它7个微烧杯放入4500Lux日光灯照射下启动反应，15min后遮光终止反应。在560nm波长下测定光密度，以2，3号杯的OD值计算出不同酶液量在其反应系统中抑制NBT光还原的相关百分率。然后以所加酶液量为横坐标，以抑制百分率为纵坐标作图，画出两者的相关曲线，找出50%抑制率的酶液量，此酶液量即为一个酶活力单位。五、结果计算总酶活力（U/g）=酶液总体积（mL）×稀释倍数抑制50%的酶液量（mL）×样品重（g）抑制率=D1-D2×100%注：此实验的简易流程为：配制各药品和试剂→筛种→洗净→消毒→洗净→吸胀→洗净→发芽→洗净→扒胚→研磨提取→离心→留上清，弃沉淀→量体积→留少量上清，将来留做测酶活和电泳用→余上清液做盐析→称盐（提前一点）→离心→留沉淀，弃上清→重溶→透析→换水→离心→留上清，弃沉淀，量体积→同前面留用的一起做测酶活和电泳→计算结果→实验结束聚丙烯酰胺凝胶电泳：吕宪禹主编，蛋白质纯化实验方案与应用，化学工业出版社，2010，第13章。P169