超氧化物歧化酶的生产

项目二超氧化物歧化酶的生产超氧化物歧化酶（英语：Superoxidedismutase，简称SOD）是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶。它广泛存在于各类动物、植物、微生物中，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞。SOD的概况：1.超氧化物歧化酶（SOD）的概念：超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶，是生物体内抗氧化酶系中主要成员之一。2.SOD的分类按其结合的金属离子（即金属辅基的成分）可分为：（1）Fe-SOD（2）Mn-SOD（是SOD酶分子内所含金属离子Mn2+）（3）Cu-Zn-SOD（铜．锌超氧化物）3.SOD的生产：仪器、试剂和材料：-研钵，石英砂，烧杯（50mL），玻璃棒，pH计，冷冻离心机，离心管-新鲜蒜瓣-0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.8），氯仿-乙醇混合液（氯仿-无水乙醇3：5），丙酮（用前预冷至-10℃）。操作步骤：整个操作过程在0到5℃条件下进行。（1）SOD酶的提取称取5g大蒜蒜瓣，加入石英研磨破碎细胞后，加入0.05mol/L的磷酸缓冲液（Ph7.8）15ml，继续研磨20min，使SOD酶充分溶解到缓冲液中，然后6000r/min冷冻离心15min，弃沉淀，取上清液。（2）去除杂蛋白上清液中加入0.25倍体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，6000r/min离心15min，弃去沉淀，得到的上清液即为粗酶液。（3）SOD酶的沉淀分离粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000/min离心15min，得到SOD酶沉淀。（4）将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液5mL中，然后6000r/min离心15min，放弃沉淀，取上清液，用凝胶sephacylS-200进行纯化，然后超滤浓缩。（5）用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量（6）将浓缩冷冻干燥后即得成品。4.SOD酶的检验：原理：连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出氧气，生成带色的中间产物。在自氧化过程的初始阶段，黄色中间产物的积累在滞后30~45s后就与时间成线性关系。中间产物在420nm处有强烈的光吸收，在有SOD存在时由于它能催化生成氧气与过氧化氢，从而阻止了中间物的积累，通过计算就可以求出SOD的活力。所需溶液的配制：（1）pH值为8.30的50mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液：25℃下96.5mL1mol/L的LK2HPO4与3.5mL1mol/L的KH2PO4混合后，用水稀释至2000mL。（2）0.05mol/L连苯三酚溶液：称取3.15g连苯三酚用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至500mL。酶活性的测定：（1）连苯三酚自氧化速率的测定在10ml试管中加入pH值为8.30的50mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液4.50ml，在25±0.5℃的恒温水浴中保温10min，然后加入在25±0.5℃的恒温水浴中事先预热好的连苯三酚溶液（空白管用10mmol/LHCL代替），迅速摇匀倒入1cm比色皿中，以空白管为参比，在325nm下，每隔30s测1次吸光值，连续记录3min，调节连苯三酚溶液用量，将其自氧化速率控制在0.070（±0.002）D/min。经实验测得连苯三酚溶液的用量为6µ1。（2）样品活性测定在10ml试管中加入pH为8.30的4.5ml50mmol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液和一定体积的样液，在25±0.5℃的恒温水浴中保温10min，然后加入在25±0.5℃的恒温水浴中事先预热好的连苯三酚6µ1，（空白管用10mmol/LHCL代替），迅速摇匀倒入1cm比色皿中，以空白管为参比，在325nm下，每隔30s测1次吸光值，连续记录3min，调节样液体积，使样液中连苯三酚的氧化速度控制在0.035（±0.002）D/min，记录此时样液体积。SOD使用及生产时的注意事项1.SOD的安全性大量试验和临床应用表明，无论何种给药方式，除罕见的超敏反应外，SOD对人体无毒性。虽然SOD是Mr在30000以上的蛋白质，但却未发现具有抗原性，其原因也正在进一步研究中。2.SOD生产时的注意事项（1）在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底（2）PH的控制力度很重要，以及在实验中的温度等（3）要学会正确使用分光光度计紫外分光光度法测定蛋白质含量：本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。该测定法具有简单灵敏快速高选择性，且稳定性好，干扰易消除不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。拓展：超氧化物歧化酶按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜（Cu）锌（Zn）金属辅基的称（Cu.Zn—SOD），最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内；第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。基本功效：抑制心脑血管疾病，抗衰老，防治自身免疫性疾病，肺气肿，辐射病及辐射防护，老年性白内障，抗氧化，预防慢性病，抗疲劳，消除副作用，避免二次伤害，化解女性的危机。SOD属于人体内自身就含有的一种抗氧化酶，（如蛋白酶、唾液淀粉酶等都属于酶类），而抗氧化剂是一种单线补充。酶参与人体化学反应，所有的新陈代谢都有酶类参与，所以他的起效和吸收是建立在人体化学反应上的，而抗氧化剂真正生物利用率低，需要在体内进行转化后才能被人体吸收利用，所以相同剂量的酶和抗氧化剂，酶的效果高于抗氧化剂的1000倍以上。SOD，可去除氧自由基，保护皮肤，减缓衰老。但是SOD本身是活性极高、易变性的物质。姑且不算SOD的分离和提取，单保存SOD，设备投入也得在10万元以上。提取SOD本身的技术含量比较高，对原料、生产环境、设备与工艺的要求都非常严格，一套完整的小型提取设备(包括离心分离机、温度可控夹层锅、柱层析设备、超滤设备、萃取设备、反渗透纯水器、冻干机、冷冻设备等)，至少在100万元以上。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲液提取。由于SOD不容于丙酮，可用丙酮将其沉底析出。有机溶剂沉淀的原理是：有机溶剂能够降低水溶液的介电常数，是蛋白质分子之间的静电引力增大。同时，有机溶剂的亲水性比溶质分子的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水，破坏其表面的水化膜，导致溶质之间的相互作用增大而发生聚集，从而沉淀析出。紫外分光光度法：原理：可见光、紫外线照射某些物质，主要是由于物质分子中价电子能级跃迁对辐射的吸收，而产生化合物的可见紫外吸收光谱。基于物质对光的选择性吸收的特性而建立分光光度法或称吸收光谱法的分析方法。它是以朗伯──比耳定律为基础。朗伯—比耳定律A=lg—-=ECL式中A为吸收度；T为透光率；E为吸收系数，采用的表示方法是（E1%1cm），其物理意义为当溶液浓度为1%（g/ml），液层厚度为1cm时的吸收度数值；C为100ml溶液中所含被测物质的重量（按干燥品或无水物计算），g；L为液层厚度，cm。