第八章哺乳动物基因工程-BiotechnologySe

生物工程专业核心课程基因工程华东理工大学张惠展基因工程523416789基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本条件基因工程的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建大肠杆菌基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程D高等哺乳动物的基因转移8哺乳动物基因工程C高等哺乳动物的载体系统B高等哺乳动物的受体系统A高等哺乳动物基因工程的基本概念E利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白A高等哺乳动物基因工程的基本概念8哺乳动物基因工程高等哺乳动物基因工程高等哺乳动物细胞基因表达技术高等哺乳动物转基因技术转基因动物个体动物工程细胞哺乳动物遗传性状改良药物筛选研究评价模型人体基因治疗蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型B高等哺乳动物的受体系统8哺乳动物基因工程高等哺乳动物细胞的生长特性高等哺乳动物受体细胞的条件高等哺乳动物受体细胞的遗传标记常用的高等哺乳动物受体细胞高等哺乳动物细胞的生长特性正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。高等哺乳动物受体细胞的条件以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件细胞系特征丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大遗传稳定性外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存合适的标记便于转化株的筛选和维持生长快且齐分裂周期短，生长均一，便于控制规模培养大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能安全性能好不合成分泌致病物质，不致癌满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）次黄嘌呤核苷（HR）GMPAMP尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）胸腺嘧啶核苷（TR）嘌呤核苷酸生物合成途径嘧啶核苷酸生物合成途径次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）（TK）胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤（AP）氨基喋呤（AP）从头合成途径补救合成途径高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk-）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补（hprt-）高等哺乳动物受体细胞的遗传标记哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH-氨基糖苷磷酸转移酶G418APH灭活G418DHFR二氢叶酸还原酶氨甲喋呤DHFR变体抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸转移酶潮霉素BHPH灭活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤TK合成TMPXGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA灭活Xyl-A常用的高等哺乳动物受体细胞迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其优势有如下几个方面：遗传背景清楚，生理代谢稳定与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确基因转移和载体表达系统完善耐受剪切力，便于大规模培养被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS）C高等哺乳动物的载体系统8哺乳动物基因工程人腺病毒DNA猴空泡病毒DNA（SV40）人乳多瘤病毒DNA（BKV）人牛痘病毒DNA人腺病毒DNA腺病毒科为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒腺病毒的生物学特性有6个亚属，其中常用来构建载体的主要是C亚属的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。人腺病毒DNA腺病毒的基因组DNAITRITRE1E2E3E4IVa2VAL1L2L3L4L5腺病毒基因组DNA全长36kb，其包装上限为原基因组的105%，DNA两端各有一个反向重复序列（ITR）；E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子，L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期基因；IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。E3区缺失只会影响病毒颗粒的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.2kb的片段，使得载体的装载量提高到4kb以上。人腺病毒DNA基因重排低外源基因与病毒DNA重组后能稳定复制几个周期腺病毒DNA载体的特点安全性能好不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤宿主范围广对受体细胞是否处于分裂期要求不严格使用效果好外源基因在载体上容易高效表达猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp的双链环状DNASV40的生物学特性SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从而使其DNA形成类似核小体的微型染色体结构。SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，便发生非同源整合而致癌。猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40的基因组DNAt/T基因编码病毒的小抗原和大SV40DNAoriVP2TVP3VP1t抗原与病毒的致癌作用密切相关SV40在裂解宿主细胞前的晚期状态时，每个宿主细胞含有105个病毒DNA拷贝，因此十分适合用于高效表达外源蛋白猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40DNA-质粒DNA杂合载体的构建重组的SV40DNA分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。为了尽量提高SV40的装载量，必须删除一些基因片段，因此重组的SV40分子必须与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感染力的重组病毒颗粒。AproriviralgenegptSV40oripV2-GPTpBR322pBR322SV40pV2-GPT是一种SV40DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔b-珠蛋白.猴多瘤病毒DNA（SV40）利用SV40DNA载体表达外源基因的程序SV40载体病毒晚期基因启动子筛选标记ori缺陷的SV40辅助病毒去除细菌序列插入外源基因重组分子分离病毒DNA转化筛选增殖感染猴多瘤病毒DNA（SV40）基因表达好外源基因能高效表达SV40DNA载体的特点基因重排高病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象宿主范围窄只能转染猴细胞装载量较小人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒（BKV）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因组为双链DNA，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自人乳多瘤病毒的生物学特性主复制，每个宿主细胞最高可达500个拷贝人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒表达载体的构建BKV-E.coli穿梭载体BKVoriBKVgeneDREMMTPAprE.colioriSV40PNeor删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成穿梭载体，它不能整合，同时也不能形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。安装细胞色素P450dioxin介导的增强子DRE，控制小鼠乳腺癌启动子MMTP，由其带动外源基因的表达。SV40来源的启动子控制Neor标记基因，以G418筛选重组子。以此载体在人细胞系中表达b1-干扰素和单纯疱疹病毒B蛋白获得成功。人牛痘病毒DNA人牛痘病毒是一个大型DNA病毒，基因组长185kb，能在宿主细胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建人牛痘病毒的生物学特性出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的病毒启动子的控制下高效表达。然而由于牛痘病毒基因组较大，体外DNA重组很困难，因此通常采用体内重组的方式进行。人牛痘病毒DNA目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编码基因。在人牛痘病毒DNA表达载体的构建外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。人牛痘病毒DNA利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序牛痘病毒启动子T7RNA聚合酶基因T7启动子外源基因细菌重组质粒感染转化培养收集D高等哺乳动物的基因转移8哺乳动物基因工程哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的病毒转染法哺乳动物细胞的物理转化法利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻了负担。但外源基因表达盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随机整合在染色体DNA上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。哺乳动物细胞的物理转化法将待转化的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2溶液混匀，此时DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便进入受体细胞；磷酸钙共沉淀法将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37℃保温4-16小时弃去DNA溶液，加入新鲜培养基，继续培养7天即可筛选转化株。如果在外源DNA中掺入少量的受体细胞内源性DNA可以提高转化效率。利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒DNA，可使正常细胞转化为癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最早理解。哺乳动物细胞的物理转化法将待转化的DNA溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在悬浮液中的淋巴细胞等。电击转化法DNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。哺乳动物细胞的物理转化法将待转化的DNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。合，DNA随即进入胞质和核内。利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa脂质体介导法将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融细胞。哺乳动物细胞的物理转化法通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌鼠，从其输卵管内取出受精卵；性原核内。上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操显微注射法借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄作，所以不太适用于基因的克隆和表达。哺乳动物细胞的物理转化法血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞同时，外源DNA也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可恢复原来的通透性。因此，可先将外源DNA转入血影细胞，然后再将血影细胞介导法核结构。在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源DNA转入受体细胞。哺乳动物细胞的病毒转染法以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。E