第十二章遗传工程幻灯片讲义-PowerPointPre

第12章遗传工程本章教学时数：2学时。本章重点：基因工程的基本流程。本章难点：分子标记和基因图谱；研究基因功能的方法§1遗传工程概述遗传工程：细胞工程酶工程发酵工程基因工程遗传工程的概念遗传工程（geneticengineering），也称生物工程（biologicalengineering）。是指利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或更适合人类需求的产品的遗传学手段。广义遗传工程和狭义遗传工程：广义：包括细胞工程、基因工程、酶工程和发酵工程等。狭义：基因工程。细胞工程在离体（invitro）条件下以细胞为基本单位，借助人工培养基，对生物细胞进行培养、繁殖，或者使其发生变异，从而改良生物品种、创造新品种、加速繁育，或利用细胞培养生产有用物质的过程。细胞工程包括细胞培养、细胞融合、细胞器转移、生物体的克隆与规模化繁殖等。第一个哺乳动物的克隆——Dolly羊酶工程利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品。是酶学理论与化工技术相结合的新技术体系。发酵工程利用微生物与现代化工程技术相结合，工厂化生产人类需要的物质的一种技术体系。目前医用抗生素、农用抗生素绝大部分都是发酵工程产品。基因工程利用人工方法在体外（invitro）切割、拼接、重组生物的遗传物质，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改良。基因工程操作的对象是DNA分子。又称为重组DNA技术重组DNA技术流程§２基因工程的工具酶内切核酸酶(endonuclease)DNA连接酶(ligase)DNA聚合酶（DNApolymerase）RNA聚合酶（RNApolymerase）反转录酶（reversetranscriptase）最重要的工具酶是限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）限制性内切核酸酶或称限制性酶(restrictionenzyme),是基因工程最重要的工具。在细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。这类酶能识别双链DNA分子中特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连DNA分子切断。EcoRⅠ限制性内切核酸酶的命名原则：根据分离出这种酶的细菌在分类学上的属名、种名和菌株名来命名。名称的第一个字母是该细菌的属名的第一个字母，大写，斜体。名称的第二、三个字母是该细菌种名的前两个字母，小写，斜体。名称的第四个字母是菌株的名称，大写或小写，正体。如果没有菌株名称就不写。名称最后的是罗马数字，表示从这种细菌中分离出来的酶的序号，如从某个菌株中分离出来的第一种酶为Ⅰ，第二种酶为Ⅱ，等等。如EcoRⅠ来自大肠杆菌（Escherichiacoli）R菌株，读作echo-r-one；HindⅢ来自流感噬血杆菌（Hemophilusinfluenzae）d菌株,读作hind-three限制酶的分类限制性核酸内切酶的工作分为2个步骤：识别特定的DNA序列在特定的位置切割DNA分子根据其作用特点,可以将限制性酶分为三种类型：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型。在基因工程中用途最广泛的是Ⅱ型限制酶。Ⅰ型限制酶有特定的识别序列但切割位置远离识别位置有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割DNA分子在基因工程中没有什么用途Ⅲ型限制酶有特定的识别序列切割位置在识别序列3’端相距20bp处，可以产生各种类型的单链末端。Ⅲ型限制酶在基因工程中有特定的用途，但总体来说，用途不大。Ⅱ型限制酶在DNA上有特定的识别序列而且其切割位点就在识别序列内部基因工程中用途最广识别序列是对称的，在一条链中从5’到3’方向的序列与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同，称为回纹对称序列(palindrome)。酶切与连接常见内切酶DNA连接酶(DNAligase)•共价连接5′－磷酸和3′－OH，形成磷酸二酯键(3′－5′phosphodiesterbond)，封闭DNA双链上的缺刻(nick)。反转录酶reversetranscriptase§3载体(vector)将外源DNA片段运送进宿主细胞(hostcell)进行扩增或表达的运载工具称为载体。载体也是DNA分子。常用载体：细菌质粒、噬菌体、病毒等。都要经过人工改造。细菌人工染色体（BAC）酵母菌人工染色体（YAC）人类人工染色体（HAC）载体的基本条件①有独立的复制原点(ori)，能独立地自我复制，而且能带动外源DNA一起复制。②具有多种限制性酶的切点，用于连接外源DNA片段。③载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限制酶来说只能有一个。④具有一个选择标记基因。质粒载体①分子量小(2.69kb),但能携带较大的外源片段；②拷贝数多,在每个宿主细胞可达500个；③酶切位点多，克隆方便；④具有α-互补显色表型,便于检测。互补显色反应λ噬菌体（30kb）粘粒（cosmid）载体（45kb）细菌人工染色体BAC（300kb）bacterialartificialchromosome来源于F因子YAC（1Mb）yeastartificialchromosomeTi质粒Ti质粒是根癌农杆菌的染色体外遗传物质双链闭合环状DNA，150～200kb植物基因工程常用的载体Ti质粒结构T-DNATransferDNA是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到植物细胞的一段DNAT-DNA两端个有一段25bp的同向重复序列，是T-DNA的边缘区LB；RB在同一条单链的LB和RB内各形成一个缺口，单链T-DNA进入植物细胞§4基因的分离与鉴定从基因库中分离基因聚合酶链式反应(PCR)扩增基因人工合成基因T－DNA标签法(一)从基因库中分离基因1．构建基因库2．筛选基因库3．阳性克隆的分析与鉴定1．构建基因库基因库(library)是一组DNA或cDNA序列克隆的集合体。创建基因文库的目的是从特定的材料中分离目的DNA片段或基因。把所有的基因集中在一个库中，采用一定的方法在库中筛选目的基因。同时也便于基因的长期保存。基因组文库GenomicDNAlibrary使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的基因组DNA切割成许多片段将所有片段连接到载体上，构成一个重组DNA群体这个群体包含全基因组的遗传信息cDNA文库cDNAlibrary以mRNA为模板，经反转录酶合成互补DNA(complementaryDNA，cDNA)将双链cDNA与适当载体连接转化到宿主细胞内进行扩增，建成cDNA文库基因组文库与cDNA文库的比较：基因组文库包含基因组的所有基因cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列分离特定基因，cDNA库比较方便研究调控序列，必须基因组文库从基因库中筛选特定的克隆一个基因文库中有几万个克隆，目的基因到底在哪个克隆上呢？根据待选基因相关信息确定筛选方法和条件。最常用的方法是利用一段核苷酸序列作探针，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，筛选基因库DNA探针（probe）探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列DNA、cDNA、寡聚核苷酸单链、双链同位素标记、荧光标记、颜色标记筛选文库质粒基因库筛选细菌混合液在培养在平板上转移到尼龙膜上裂解细菌变性DNA标记探针杂交漂洗放射自显影或荧光检测挑取对应菌落、培养抽提质粒阳性克隆的分析与鉴定从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因测序自动测序仪功能分析预测软件核酸序列测定的原理磷酸二脂键测序电泳图谱核酸序列分析与功能预测同源性比较同源基因是指那些起源相同、序列相似的基因。可从核酸及蛋白质两种水平比较基因间的同源性。将测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较将得到的序列发到BLAST等DNAData库的网址上比较开放阅读框（openreadingframe,ORF）分析开放阅读框：一段能编码一条多肽链，并具有翻译起始信号（ATG）和终止信号(TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。来自cDNA库的序列可直接进行0RF分析，比较其与其他序列的同源性来确定其身份。来自核基因库的序列，因大多数真核生物基因含有内含子。开放阅读框（openreadingframe,ORF）分析•TGCTCGCTCCTACGAATCCTGCCCCTGAGTAACAATGACTGACTTTTAATTTGTTTGCAG•61CTAGGGTGGGGATCGAGATGGTGATCTTGGAGCAGCCACAGCTGCTCCTTCTTCTTCTTC•121TTCTTGTAGCAGCTGCAGCTGCAACCGGCGCCACAGCAGCCGACGACGAGTTGGAGTGTC•181CCTCCTCCATCTTCGGTAAGTAGCAAAGCACAGTATGACATTCACGAATGCATGTCATGA•241TCTATCACTCCCTTTGTCTTCGCTACATTACATACTCTGCCTGTGTTTACCTACTGTACC•301CGTCTTCAATTCAATTTGCTGTTGGCTCCCGCGCTTTCCCGAAGCCGCGTGTAGTAGTAT•361CATAAAAGTAGGAGTAGATCTTTAATTTGCCCGGCGAAAACTGCTCCTAGTGGTAGATCT•421TTGGCTCGGATCGGAGAAGATATTGTAGCTGTACTCTGATCGAGAGCATGCATGCTTGTT•481AATCCGATCGAGCGTATTCCTCTGAGTTTGTTATGCTCTGATATTGTAATTGTGGCTGGA•541TAATTTTCAAGAAAAAAAAATCGGTTACATACATGCATTTGCACTAATTAACTAGATTGT•601GCATCAACAGATCACGCTGTGAACTCTCAAGGCGCCATTCAGTTCCCCGTGTTCCACAAG•661AAGCACCAATGCCTCCGCCCATGGTCTGTCCGTGCAACCCAGGCATCCTCGACCGGAGCA•721TCAGGAGCAGGAAAAGGAGGAGGATTGAACAATCTACAGGAAGAGGAGATCACTTCATCA•781AGTAGTACAAAAATCGACGTGATCGAAGACAGCAGCATCAACGACTTCCTGTTCCTAATG•841GCCGTCAGTCTGGGCAAGCCACCGGTTGTGAACCTGGTGGCGATCGACACGGGATCCACC•901CTCTCGTGGGTGCAATGCCAGCCGTGCGCGGTGCACTGCCACACGCAGTCCGCGAAGGCC•961GGCCCGATATTCGATCCCGGCAGATCCTACACATCCCGGCGAGTTCGCTGCTCGTCGGTC•1021AAGTGCGGCGAGCTGAGGTACGATCTGCGGCTCCAGCAAGCCAATTGCATGGAGAAGGAA•1081GACAGCTGCACGTACAGCGTCACGTACGGGAACGGGTGGGCGTACAGCGTGGGCAAGATG•1141GTGACAGACACGCTGAGGATTGGGGACTCGTTTATGGATCTCATGTTCGGGTGCAGCATG•1201GATGTCAAGTACAGCGAATTCGAGGCCGGCATCTTTGGTTTCGGCAGCAGCAGCTTCTCT•1261TTCTTCGAGCAGCTGGCAGGGTACCCTGATATTCTGAGTTACAAGGCATTAAGCTACTGC•1321TTGCCCACTGACGAGACCAAGCCCGGATACATGATCCTGGGAAGATACGACCGTGCCGCC•1381ATGGATGGGGGTTACACTCCTCTCTTCCGGT