聚丙烯酰胺凝胶配制方法

5×TBE（组份浓度：5×TBE，pH8.3；配制量：1L）：称取53.9gTris，27.5g硼酸，量取20ml0.5mol/LEDTA（pH8.0），置于1L烧杯中；加入约800ml超纯水，充分搅拌溶解；加超纯水将溶液定容至1L；室温保存。10%过硫酸铵（组份浓度：10%(W/V)过硫酸铵；配制量：10ml）：称取1g过硫酸铵，置于10～50ml烧杯中；加入约8ml超纯水，搅拌溶解；加超纯水将溶液定容至10ml；4℃保存（保存时间为2周左右，超过期限过硫酸铵将失去催化作用）。30%丙烯酰胺（组份浓度：30%(W/V)丙烯酰胺；配制量：1L）：称取290g丙烯酰胺，10gN,N'-亚甲基双丙烯酰胺，置于1L烧杯中；加入约600ml超纯水，水浴加热至37℃，充分搅拌至溶解；加超纯水将溶液定容至1L，用0.45μm滤膜过滤除去杂质；并检测该溶液pH值应不大于7；棕色瓶4℃保存。0.1%AgNO3（组份浓度：0.1%(W/V)AgNO3；配制量：1L）：称取1gAgNO3，置于1L烧杯中；加入约800ml超纯水，；加超纯水将溶液定容至1L；棕色瓶室温保存。显色液（组份浓度：2%(W/V)NaOH，0.04%(W/V)Na2CO3，0.4%(W/V)37%甲醛；配制量：1L）：称取20gNaOH，0.4gNa2CO3，置于1L烧杯中；加入约800ml超纯水，充分搅拌溶解；加4ml37%甲醛溶液，加超纯水将溶液定容至1L；室温保存。10%冰乙酸（组份浓度：10%冰乙酸；配制量：1L）：量取100ml冰乙酸，置于1L烧杯中；加入约800ml超纯水，搅拌混匀；加超纯水将溶液定容至1L；室温保存。2.2.6电泳检测2.2.6.1玻璃板清洗首先用去污粉将电泳用玻璃板、胶垫、梳子等反复清洗；然后用Ⅲ级蒸馏水漂洗2～3次，直至玻璃板表面出现均匀水膜，既不聚成水滴，也不成股流下；再用超纯水漂洗1次，晾干；最后用无水乙醇擦拭，晾干备用[74]。2.2.6.2缓冲液贮液和凝胶母液的制备缓冲液贮液用5×TBE，具体配制方法见2.1.2.2，用时稀释5倍。凝胶母液用30%丙烯酰胺，具体配制方法见2.1.2.2。2.2.6.3聚丙烯酰胺凝胶的制备10%非变性聚丙烯酰胺凝胶（两块，约55ml）各组分用量如下[58]：30%丙烯酰胺：18ml5×TBE：11ml超纯水：25mlTEMED：36l10%过硫酸铵：385l具体操作步骤如下[75]：首先，按要求组装好垂直电泳板，两块玻璃板的底部用1.5%琼脂糖封边，防止封闭不严而导致聚丙烯酰胺胶液漏出。然后，灌胶。分别量取配比用量的30%丙烯酰胺、5×TBE和超纯水置于100ml烧杯中，用玻璃棒搅拌混匀；然后用微量加样器加入配比用量的10%过硫酸铵和TEMED，加入后聚合即开始，迅速摇匀；立即用玻璃棒引流，将混合液灌注于两块玻璃板之间，灌胶过程一次性完成，避免产生气泡；灌胶完成后，一次性平稳插入样梳以形成点样孔。最后，待聚合完全后往电泳槽中加入1×TBE缓冲液直至没过点样孔，且正负极槽内缓冲液高度应一致。聚合时间一般在30～60min左右，凝胶聚合完全的标志是点样孔附近形成清晰的界面，轻轻拔去样梳，避免破坏点样孔，并立即用电泳缓冲液冲洗点样孔，以清除点样孔中的气泡和未凝固完全的胶液。2.2.6.4电泳取PCR扩增产物5l与1l上样缓冲液混合均匀后点入点样孔，用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以20bpDNAladder（Takara）作为分子量标准，缓冲液为1×TBE。接通电源，恒压180～200V，电泳8～10h，直至溴酚蓝距离凝胶边缘约1cm时，停止电泳。2.2.6.5银染、显色具体步骤如下[76-78]：（1）卸下玻璃板，用塑料薄片撬去上面一块玻璃板，并小心除去下方的琼脂糖凝胶；然后将附有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板以凝胶面朝下浸入盛有约200ml超纯水的玻璃器皿中，凝胶即脱落于水中，轻轻摇晃15sec，倒掉液体；（2）加入约200ml0.1%AgNO3，置于摇床之上，以轻摇20min左右，倒掉液体；（3）加入约200ml超纯水，轻摇15sec，倒掉液体；（4）加入约200ml显色液，轻摇5～10min，直至出现清晰带型，倒掉液体；（5）加入约200ml超纯水，轻摇15sec，倒掉液体；（6）加入约200ml10%冰乙酸，固定；（7）用Bio-Rad紫外凝胶成像系统观察，照相以记录电泳结果。1.4.3聚丙烯酰胺凝胶改进的银染方法(1)电泳结束后切断电源,从电泳槽中倒出缓冲液,然后取下胶板,将凝胶从玻板中取出放入装有蒸馏水的瓷盘中,用蒸馏水漂洗2次。(2)银染:加入染色液(0.2%的AgNO3、1%的冰醋酸、10%的无水乙醇)进行银染,然后用蒸馏水漂洗2次。20min(3)显影:加入显影液(3%的无水NaOH,每200mL溶液加1mL甲醛)进行显色。8min(4)凝胶摄影:用数码相机对凝胶进行照相。