肌钙蛋白I的检测方法进展

1肌钙蛋白I的检测方法进展心肌肌钙蛋白(cardiactropnin，Tn)是1987年Cummins等诊断急性心肌梗塞(acutemyocardialinfarction，AMI)时首次报道的，肌钙蛋白(Troponin，Tn)是心肌的主要结构收缩蛋白，由三个亚单位组成：肌钙蛋白C(TnC)、肌钙蛋白T(TnT)和肌钙蛋白I(TnI),其中TnI又分为3种亚型：快骨骼肌亚型(fTnI)、慢骨骼肌亚型(sTnI)和心肌亚型(cTnI)，个体出生9个月后，心肌中仅存cTnI,无任何亚型，其分子量24kDa，由209个氨基酸组成，有超过40%的氨基酸序列与其他亚型有异源性,且氨基端多延伸出一段32个氨基酸组成的序列,所以cTnI具有高度的心肌特异性，已被临床广泛接受，不仅成为诊断急性心肌梗死的“金标准”，而且已成为心肌疾病病情监测、疗效观察及预后评估的最合适标志物。本文就cTnI的实验室检测方法综述如下：1酶联免疫吸附试验法酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）法已成为一种经典的、被广泛应用于临床的免疫测定技术。此种方法用于cTnI的检测最初是在80年代中期由Cummins等报道的，采用了多克隆抗体竞争抑制法，交叉反应无法消除，存在较大的局限性。1992年Bodor等在此基础上对ELISA法进行了改良，筛选出一对与cTnI亲和力强的单抗，采用单克隆的双抗体夹心法，使灵敏度提高到0.5μg/L。1993年Larue等在Bodor等的研究基础上，从28种纯化的单克隆抗体中筛选出一种特异性很强的抗体用于免疫分析，以辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP）取代碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP)，检测限精确至0.1～0.2μg/L，检测时间30min。目前，ELISA法已成为检测cTnI较为成熟的方法。2化学发光法化学发光免疫分析系统采用了双抗体一步夹心酶免疫分析的方法，以化学发光剂3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酸氧基)苯-1,2-二氧杂环丁氨(AMPPD)为底物，以ALP作为标记物，用单克隆抗cTnIIgG抗体包被的磁性微粒为固相载体,检测时待测抗原与包被在固相载体的抗体及ALP标记的抗体形成2夹心复合物,发光剂AMPPD在ALP催化下脱去磷酸根基团生成具有荧光活性的AMPD，测定其发光强度，通过多点定标曲线计算cTnI浓度。最具代表性的是美国BeckmanCoulter公司的Access微粒子化学发光免疫分析系统，该系统反应快速，最低检出浓度为0.03μg/L,CV5%,准确度可达97.8%。何农跃等对化学发光酶免疫测定cTnI分析系统进行了实验条件的优化研究，使检测限达0.02μg/L。电化学发光免疫分析系统是以细小的顺磁性微粒为固相载体,以小分子化学发光剂吖啶酯直接标记抗原或抗体,反应洗涤后，碱性条件下检测其发光强度，从而对cTn-I定量。Bayer公司的ACS-180电化学发光免疫分析系统最具有代表性。3荧光分析法3.1Stratus检测法Stratus检测法是一种自动化双位点荧光酶免疫定量检测法，第一家通过美国FDA批准的检测系统是DadeStratusⅡ检测法，后来开发的cTnI分析系统较多是以它作为测定基准。这种方法使用两种cTnI单抗隆抗体，特异性高，检测低限0.35μg/L。3.2ELFA法酶联荧光分析法（ELFA法）是由法国生物梅里埃公司开发的，采用一步免疫荧光法，以荧光剂4-甲基伞形酮磷酸盐(4-MUP)为底物，以标记ALP的抗cTn-I单克隆抗体包被固相载体(SPR)，吸入血清样品，与包被的cTn-I抗体结合，并固定于SPR内壁形成夹心，未结合的cTnI通过洗涤被除去,4-甲基伞形酮磷酸盐被ALP催化水解成4-甲基伞形酮,在450nm处检测其荧光值(relativefluorescencevariation，RFV),与标准曲线比较自动计算血清cTnI浓度,检测范围0.1～50μg/L，CV5%,检测时间15min。3.3TRFIA法时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA法），针对cTnI上不同抗原决定簇的两个单克隆抗体，一个包被固相载体，另一个用Eu3+标记，经过免疫反应形成免疫复3合物后，用增强液将Eu3+从复合物上完全解离下来，与另一种螯合剂结合，检测荧光信号；荧光信号强弱与cTnI含量成正比。4金标免疫法金标免疫法主要是应用到与免疫层析技术相结合的金免疫层析法（GCIA）中，用两个单克隆抗-cTnI抗体的单一结合来检测游离cTn-I和复合cTn-I。当样本滴到吸收孔内，第一个抗cTn-I抗体/胶体金与cTn-I结合形成一个抗体/抗原结合体。第二个固定化的抗cTn-I抗体捕捉这个结合体，产生一个粉红色的颜色带，相对于无结合体出现，反应圈内就没有色带。周荣斌等采用胶体金免疫层析法检测急性心肌梗死患者血中cTnI，试验cTnI特异性为98．0％，相对敏感度为97．4％，能较好的检测患者血样中的cTnI，且操捷、简便，适用于临床特别是急诊科用于AMI的辅助诊断。但该方法易受主观因素的影响，于是有研究者开发了一种利用光度计及荧光计辅助检测的方法，以避免主观因素的影响。近年来，在免疫金技术的基础上，有研究者增加了一个对标记物进行银染色放大的过程，使得免疫金标记的结合位点可以被很容易地清晰观察到，称为免疫金银染色法(IGSS)，该方法使检测灵敏度进一步提高，在cTn-I的检测中具有广阔的应用前景。5免疫比浊法陈海彪采用胶乳增强免疫比浊法测定cTnI，该法将cTnI与包被有特异性抗体的致敏胶乳颗粒结合,使相邻的胶乳颗粒彼此交联,测定一定波长下溶液浊度增加的程度与标本中的cTnI含量相关。这种方法灵敏度达0.3ng/ml，特异性强，重复性好，线性范围宽，操作简便、快速，具有一定的临床应用价值。陈浩全等比较了3种cTnI试剂在自动生化仪上的分析性能，结果显示胶乳增强免疫比浊法测定cTnI具有较高的精密度和灵敏度，与化学发光免疫分析具有良好的相关性。6飞行质谱法又称为表面增强激光解析离子化（SELDI）,由蛋白质芯片、飞行质谱和分析软件组成，该技术是通过测定样品离子的质荷比(M/Z)来进行成分和结构的4分析，将样品点样到芯片后，芯片特异地和血清中的测定蛋白结合，选择性清洗后，加入能量吸收剂，使芯片上保留的蛋白形成晶体，晶体经特异激光照射发生解离作用，带电分子在通过质谱电场时加速向阴极飞去。每种蛋白飞行时间不同，其在图谱上的位置也不同，蛋白质量越轻，相对所带的电荷越多，则质荷比(M/Z)越小，飞行时间越短，这些信号经高速模拟数字转化器处理，可得到蛋白质指纹图谱。魏晓真报道了飞行质谱法检测cTnI的临床研究,研究表明飞行质谱法灵敏度、特异性高，可快速、准确诊断出早期AMI。7生物传感器最早的生物传感器可以追溯到20世纪60年代发明的酶电极，其检测原理是待测物质与生物分子识别元件发生生物学反应后，产生的信息被相应的物理或化学换能器变成可定量和可处理的电、声、光等信号，再经二次仪表放大并输出，便可对待测物进行定性和定量分析。KwonYC等采用表面等离子体共振免疫传感器（surfaceplasmonresonance，SPR），将针对cTnI蛋白84～94氨基酸肽段的单克隆抗体P-II-13交联修饰到金属薄膜上，利用金属薄膜的光学耦合产生的物理光学现象进行测定，灵敏度达68ng/L，推动了SPR技术的发展。KongT等采用CMOS兼容“自上而下”的硅纳米线场效应管，将cTnI单克隆抗体共价固定在硅纳米的表面，研制出无标记硅纳米线生物传感器，用于血清中cTnI的检测，其动态线性响应范围0.092ng/mL～46ng/mL，这种方法快速、灵敏，实用性强，值得推广。Zeng等采用多孔硅Bragg反射镜的光学生物传感器，将适配子通过3-氨丙基-三乙氧基硅烷(APTES)交联技术固定到多孔硅的表面，当cTnI和适配子结合后，多孔硅的有效折射率发生变化，通过紫外可见分光光度计检测其反射峰位的变化量来确定溶液中cTnI分子的含量。研究显示，该传感器的线性检测范围为0.05～4.00nmol/L，最低检测限0.05nmol/L。随着cTnI检测方法和检测技术的不断更新，在检测过程中也暴露出一些不容忽视的问题，cTnI测定系统缺乏标准化，使测定结果缺乏可比性，给临床应用和评价带来困扰，这种情况下，各实验室应选定一个检测系统，摸索自己的实验参考范围，建立相应的数据库，在检测过程中，注重比较cTnI的变化趋势，5而不是比较其绝对浓度，使cTnI更好地发挥其诊断价值。