肝癌表观遗传学研究的进展

基金项目：广东省医学科学技术研究基金（A2006343）；广东省科技计划项目（2010B080701063）肝癌表观遗传学研究的进展暨南大学附属第一医院消化内科汪文黄卫【摘要】肝细胞癌是高发病率和死亡率的恶性肿瘤，近年基础研究的热点集中在以基因表达、调控为主要内容的表观遗传学研究，在DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA和基因组印记等方面的研究成果为揭示肝癌发病机制和开发新的诊治手段提供了理论依据。【关键词】肝癌表观遗传学肝细胞癌（hepaticcellularcancer，HCC）是世界范围内最常见的致死肿瘤之一，其发生是一个从慢性肝炎/肝硬化和异型结节增生到肝癌的渐进、多阶段进程，迄今我们还无法确立一个明晰模式，但随着分子生物学技术的进步，逐步认识到肝癌形成与等位基因损失、染色体异常、基因突变、表观遗传变化都有密切关系，以往的研究多着眼于基因组、基因序列的改变，与之相对的是近年兴起的表观遗传学（Epigenetics）研究，即在不改变基因序列的基础上，通过多种方式改变遗传基因的功能和特性，并可通过细胞分裂和增殖周期遗传的基因组修饰方式。表观遗传可通过DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、以及非编码RNA等多种方式来实现对基因表达的调控[1]。近年来，肝癌表观遗传学研究进展集中在这几个方面：一、肝癌相关基因甲基化状态1.肝癌相关基因甲基化肿瘤的发生涉及多种基因的异常表达，甲基化状态的改变是其中的一个关键环节，在肿瘤组织中常发现基因组整体甲基化水平下调和CpG岛局部甲基化程度的异常升高。抑癌基因的高甲基化可以直接抑制其表达，是近年来研究的热点；而低甲基化却能促使致癌基因活化，细胞恶变，最终导致肿瘤发生。近期多个研究报道了肝癌启动子甲基化的基因，包括ASPP1、ASPP2、BASP1、SRD5A2、SCARA5、DLC1α、CDKN2B、SOCS1、CDH1、GSTP1、ARHI、SLIT2、T-cadherin[2-9]，这些基因可能是潜在的抑癌基因。早期甲基化研究发现常见癌基因如ras、myc甲基化水平降低，但近年来低甲基化基因的报道相对较少，如MYC[6]，是否是致癌基因尚需进一步证实。2甲基化的研究方法可帮助我们发现更多的抑癌基因，也能为基因治疗寻找新途径。有学者发现人肝癌细胞株和肝癌组织中肝细胞生长因子活化剂抑制因子2（HGFactivatorinhibitor2，HAI-2）启动子区过甲基化，其表达明显受到抑制；而体外异位表达HAI-2可抑制肝癌细胞迁移和侵袭力，体内实验证实高表达的HAI-2可抑制肝癌的发生[10]。此外评估相关基因甲基化状态还可以为临床预后提供依据，Tip30启动子甲基化程度与预后负相关，高甲基化Tip30组的患者复发率、死亡率远远高于低甲基化组。[11]。以上研究大都提出用DNA甲基转移酶抑制剂来恢复抑制基因的活性治疗肝癌[2~9]，但是这可能加重DNA广泛低甲基化的趋势，影响染色体的稳定性而促进肿瘤的形成，因此在防止癌症发生的同时，可能造成整个基因组的不稳定性增加而导致其他类型癌症的风险，因此如何提高甲基化修饰的选择性是我们面临的新课题。2.与甲基化相互作用的其它因素病毒感染是肝癌的高风险因素之一，Jung研究表明，乙肝病毒癌基因的主要产物HBX通过上调DNA甲基转移酶1和3a，促进维甲酸受体-β2（RAR-β2）启动子甲基化，同时影响某些细胞周期G（1）相关因子如p16、p21、p27水平的表达，与对照组相比较，HBX表达的人肝癌细胞，维甲酸无法诱导的细胞生长抑制；如果经过DNA甲基化抑制剂5氮杂胞苷处理，解除了对RAR-β2的抑制，对维甲酸的敏感性可以完全恢复，因此，在乙肝病毒介导的肿瘤发生过程中，乙型肝炎病毒X下调RAR-β2可能是一个关键步骤[12]。乙型肝炎病毒X还通过与DNA甲基转移酶3A（DNAmethyltransferase3A，DNMT3A）、组蛋白去乙酰化酶1（histonedeacetylase，HDAC-1）交互作用，影响多个基因如interleukin-4receptor、IGFBP3、CDH6、metallothionein-1F的表达[13]。此外HBx还可通过MyD88（myeloiddifferentiationfactor88）基因活化来促进IL-6在肝细胞和肝癌细胞中的表达[14]。Feng研究发现，在伴有HBV和HCV感染的肝细胞癌患者肝组织中，十个基因甲基化状态不尽相同，推测不同病毒感染发展为肝细胞癌有不同的表观遗传学机制[15]。Zhang等在检测120例HCC甲基化表型时发现，CIMP（CpGislandmethylatorphenotype）阳性肿瘤组织中端粒酶表达水平明显高于CIMP阴性肿3瘤组织，提示甲基化在端粒酶活性调控机制中发挥一定的作用[16]。二、组蛋白修饰组蛋白修饰是表观遗传学修饰的另一种重要机制。真核细胞细胞核中的核小体主要由四种组蛋白（H2A，H2B，H3和H4）构成，组蛋白和缠绕于组蛋白的DNA共同组成了核小体。组蛋白修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程[17]。尤其是组蛋白乙酰化、甲基化修饰能为相关调控蛋白提供其在组蛋白上的附着位点，改变染色质结构和活性。乙酰化修饰大多在组蛋白H3的Lys9、14、18、23和H4的Lys5、8、12、16等位点，它们既能激活基因也能使基因沉默。而甲基化修饰主要在组蛋白H3和H4的赖氨酸和精氨酸两类残基上。研究显示，在进化过程中组蛋白甲基化和DNA甲基化两者在机能上被联系在一起，如Iliopoulos等研究64例肝癌、42例正常肝组织和7株肝癌细胞株时发现hTERT基因表达受DNA甲基化、组蛋白H3-K9和转录因子c-myc多个途径调控[18]。活性氧簇（reactiveoxygenspecies，ROS）可诱导肝癌细胞产生Snail，一种可以下调E钙粘蛋白（E-cadherin）表达的转录因子，Snail通过恢复组蛋白去乙酰化酶1（HDAC-1）、DNA甲基转移酶1（DNMT1）诱发E-cadherin启动子甲基化，揭示了ROS致癌作用的表观遗传学机制[19]。病毒感染也常伴随组蛋白修饰，Liao等研究证实丁型肝炎病毒感染可介导丛生蛋白（clusterin）表达，丁型肝炎病毒伴随组蛋白H3过乙酰化，可能是其致肝癌发生的主要机制[20]。组蛋白修饰相关研究发现为开发肝癌诊治新方法开辟了新途径，Chang等发现肝癌及癌旁组织c-JunN-terminalkinase（JNK）活性持续升高，与肿瘤体积大小正相关，同时组蛋白H3的lys4、lys9位点甲基化，提示在肝癌发生过程中JNK通过表观遗传机制发挥重要作用[21]，可应用于肝癌早期诊断和预后评估。动物实验表明，二甲氨基偶氮苯（dimethylaminoazobenzene，DAB）可诱导组蛋白去乙酰化酶1（histonedeacetylase，HDAC-1）过表达导致大鼠肝癌发生，而茶多酚可能通过抑制HDAC-1表达而对预防DAB诱导的肝癌发生具有一定作用[22]，因此茶多酚可以作为肝癌预防和治疗的候选药物，有待进一步筛选或验证。4三、非编码RNA（NoncodingRNA，ncRNA）非编码RNA可影响染色质结构，在多种表观遗传现象中发挥作用。ncRNA按照大小可分为长链和短链2种。长链ncRNA在基因蔟以至于整个染色体水平发挥顺式调节作用，短链ncRNA在基因组水平对基因表达进行调控，可介导mRNA的降解，诱导染色质结构的改变，决定着细胞的命运，还对外源的核酸序列有降解作用以保护本身的基因组[23]。DDC（Diethyl1，4-dihydro-2，4，6，-trimethyl-3，5-pyridinedicarboxylate）可通过表观遗传修饰DNA和组蛋白致小鼠肝细胞变性，改变其细胞表型，DDC作用后可见三种非编码RNA表达异常，其中H19、反义胰岛素样生长因子2受体（antisenseIgf2r，AIR）ncRNA水平上调，GTL2/MEG3下调，停药1月后恢复，DDC诱导肝癌发生后H19、AIR的ncRNA水平持续上调。甲基供体S腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine，SAMe）可阻止DDC的作用，其机制是否通过影响H19、AIR的转录尚需进一步明确[24]。MicroRNA（miRNA）是一类能够调控基因表达的短链非编码RNA，短发夹RNA（shRNA）可被剪切形成miRNA或产生RNA干扰的siRNA。BoWang等证实CDAA（CholineDeficientandAminoAcid）饮食小鼠早期miR-181b的表达与TGF-β信号通路相关，其靶点肿瘤抑制基因TIMP3的表达明显受到抑制，miR-181b上调亦能增强肝癌细胞对阿霉素的耐药性。另有研究确定miR-221的过表达也在肝癌形成中起关键作用，提出抑制miR-221表达有望成为肝癌治疗的新途径[25，26]。但是ShellyBeer等却发现即使是无序列相关性的小剂量shRNA仍能引起肝细胞miRNA的表达紊乱，诱导凋亡，伴随肝细胞损伤，刺激相邻肝细胞增殖，加速肝脏的肿瘤发生，因此这一有前途的生物治疗技术亦存在相当的风险[27]。四、基因组印记（genomicimprinting）的异常基因组印记是一种非孟德尔的遗传规律，来自双亲的某些等位基因，在子代的表达不同，有些只有父源的基因有转录活性，而母源的同一基因则始终处于沉默状态，另一些基因的情况则相反。这是由于源自某一亲本的等位基因或它所在染色体发生了表观遗传修饰，导致不同亲本来源的两个等位基因在子代细胞中表达不同。在基因组中的这类现象就是基因组印记。印记基因的形成和表达存在一5复杂的调控机制，普遍认为与甲基化有关，并受多种因素的影响。正是由于印记是正常发育必不可少的调控机制，印记行为的异常必然引起多种相关疾病，特别是印记异常可作为一种新的致瘤机制与肿瘤的发生发展关系密切。Segat等采用等位基因荧光探针检测230名HCC患者和230名健康人，对比肝细胞癌患者和对照组34个基因中50个单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms，SNP），除rs2304052外没有发现差异，rs2304052位于富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secretedproteinacidicandrichincysteine，SPARC）基因，HCC患者表达rs2304052C等位基因与对照组比较有有统计学差别，rs2304052C等位基因表达发生HCC的风险升高（OR=2.76）[28]。许多研究证实肝癌发生、发展是一个涉及多基因、多步骤的复杂过程，除相关基因序列改变导致癌基因激活和抑癌基因失活的致癌模式外，表观遗传改变逐渐为人们所认识，而DNA甲基化、组蛋白修饰等表观调控的主要方式在肝癌发生的早期已经发生，而且大多同时或相互作用，涉及不同功能的基因，所以全面掌握不同时期肝癌表观遗传状态与规律，对阐明肝癌的发生机制、早期诊断、评价预后以及临床治疗有指导意义。参考文献1.EggerG，LiangG，AparicioA，etal.Epigeneticsinhumandiseaseandprospectsforepigenetictherapy.Nature，2004，429：446-457.2.ZhaoJ，WuG，BuF，etal.Epigeneticsilenceofankyrin-repeat-containing，SH3-domain-containing，andproline-rich-region-containingprotein1（ASPP1）andASPP2genespromotestumorgrowthinhepatitisBvirus-positivehepatocellularcarcinoma.Hepatology，2010，51（1）：142-153.3.TsunedomiR，OgawaY，IizukaN，etal.Theass