肿瘤个性化用药基因检测

一、背景介绍医学发展到今天，人类已经征服了许多疾病，但是如何攻克癌症依然是人类面临的巨大挑战。近年来癌症的发病率一直呈上升趋势，据世界卫生组织报告预测，到2025年，全球将有3亿人患癌症，并有2亿人因此而死亡；在我国癌症已列居各类死亡之首，年均癌症新发病例约为200万人。在治疗上尽管不断有新的药物和治疗手段诞生，但取得的效果不尽人意，癌症的死亡率同50年前相比没有显著降低，与此同时，心脏病，脑血管病和传染病的死亡率却降低了2/3。由于肿瘤是在体内各种因素的作用下由一系列基因连续突变导致细胞生长失去控制所致，因而每个肿瘤患者，即使同一种肿瘤，其致病因素和体内突变的基因都是不一样的，每一个患者的肿瘤都有自己独特的生物特征，这就是肿瘤的异质性。忽略了肿瘤的异质性，采用“一药一病”的疗法是肿瘤治疗没有达到理想效果的主要原因。肿瘤的异质性要求必须对每个患者“区别对待”，这就是肿瘤的个性化治疗。而基因是人类遗产信息的化学载体，决定着我们与前辈的相似和不同。研究结果表明，人类绝大部分的疾病与基因相关。人与人之间的基因99.9%相同，但正是因为那剩余的0.1%的差异，造成了人与人之间健康的差别。基因检测正是利用遗传学、分子生物学等技术进行检测分析，来发现遗传物质异常的过程。通过基因检测，我们可以了解自己的基因型，通过比对自身基因型和大规模医学试验的结果，从而评估自身是否出现某种类型的健康问题（易感风险）；另外可以对肿瘤病人个性化治疗的用药提出指导。随着人类基因组计划的完成，开展通过基因测序的个性化医学检测技术是临床个性化医学的大势所趋，成为解决一些疑难疾病如遗传性疾病以及肿瘤的重要工具。通过基因检测分析评估可能罹患的疾病和预测不同病人的药物效应，并指导临床医生为可能患者提出建议或在临床治疗药物选择时针对患者独特的遗传变异特征选择治疗方式、药物和剂量，即使治疗同一种疾病，或者同一患者的不同阶段，医生也可能根据病人的遗传背景来选择最合适、最具有针对性的治疗方式、药物和剂量，避免严重的毒副反应和医疗资源的浪费！二、方法目前基因检测的方法不胜枚举，基本的步骤是样本的获取（包括血液、唾液、组织样本等）——处理（如DNA的提取与纯化、文库构建等）——序列测定——序列分析——结果解读——报告撰写。广泛应用的核酸序列测定方法是直接测序法，目前最先进而且被广泛使用的方法和仪器有第一代的Sanger测序法，第二代的高通量测序法（如美国Illumina公司的Hiseq测序仪和华大基因子公司CompleteGenomics开发的测序方法）等。目前也已出现被称为第三代测序技术的方法，如单分子实时DNA测序法。1、第一代：sanger测序Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。原理：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。第一代的Sanger测序技术的优点是，测序读长长，能达到800-1Kbp，且测序用时短，只需要几十分钟即可完成一次测序，测序准确度高，目前仍是测序的金标准；缺点是通量低、成本高。Taqman法：应用一对双标记Taqman探针，分别针对双等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针扩增出各自对应的基因型；用两种荧光染料FamHex（Vic）分别标记这两种探针，就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。准确性好，适合于大量样本、少量位点，价格贵，缺点是不能读出序列，不太直观。质谱法：准确性较好，缺点只能读出质量数据，不能读出序列，对于缺失和插入突变无法读出，但这种突变更加可怕，适合于大量样本、多位点（最多能检测25个位点），所以可能会出现少量假阳性和假阴性。2、第二代：高通量测序（NGS）第二代测序技术的优点是测序通量和效率高，成本低廉；缺点是测序读长普遍较短，且用时较长。以目前应用最为广泛的测序仪之一的illumina公司Hiseq2000测序仪为例，其一次测序的数据产出量可达500Gb，但读长为100bp，且需要耗时14天左右。而Lifetechnology公司的IonProton测序仪是边合成边通过反应体系电位的微小差别来测定碱基序列。3、第三代：单分子/纳米孔测序由于第二代技术存在短读长和耗时长的缺陷，人们希望第三代测序技术能解决这些缺陷，所以第三代测序技术在长读长和短耗时出发，目前尚未完全成熟，市场应用面还不算广，而且各种测序仪之间差异较大，测序原理也是各出奇招。如PacificBioscience公司则是通过在PCR合成DNA的过程中，用显微镜检测由荧光基团标记的dNTP反应后释放出的荧光来测序。而一直未投产的牛津大学研发的测序仪，则是通过检测由核酸外切酶剪切DNA时，“掉落”到检测微孔的核苷酸来测序。4、其他1）、基因芯片技术可以大规模对基因组特定位点多态性以及基因表达等进行检测。基本原理是基于碱基互补配对，根据预先放置的探针与靶DNA结合情况得到的信息对靶DNA进行解读。2）、用于目标区域基因拷贝数的低通量检测技术包括MLPA(多重连接探针扩增技术,multiplexligation-dependentprobeamplification),FISH(fluorescenceinsituhybridization，非放射性原位荧光杂交技术)，DigitalPCR(数字PCR技术)。3）、低通量目标序列以及SNP位点检测技术SNP位点的检测也是目前疾病风险预测、先天营养吸收、先天饮酒能力等检测主要目标。低通量的目标序列以及SNP位点检测技术主要包括TaqmanPCR技术，基于毛细管电泳的SNPlex技术（单个反应可以检测48个SNPs，来自ABI公司），SNaPshot（通常可以用于10到30个SNP位点检测）,SNPstream技术。4）、新兴的一些技术新兴的高通量DNA测序技除了提到的Illumina,IonTorrent,PacificBioScience,以及值得期待的采用纳米孔技术的Nanopore测序技术，还有较老的二代测序技术454，SOLiD技术。三、个性化用药基因检测的市场规模目前在我国，个性化用药基因检测更因为无创产前筛查高通量测序这一项目让基因检测也被人们广为熟知。数据显示，近三年来我国共有20万孕妇接受产前基因检测，市场规模约为10亿元。业内人士预计，如果无创产检针对30岁以上孕妇实现100%渗透，将为该行业带来76亿元市场容量；若针对全部孕妇实现50%渗透率，那么将带来140亿元市场容量。有人粗略估计，基因检测的中国市场规模未来将超过千亿元。然而，目前大部分基因检测项目都没有统一的规范要求和收费标准，市场的价格较为混乱。同时，现在国内测序公司太多了，小公司到处都是，但是大多数是一些拉业务的代理公司，拉到的业务都是去给他们的总公司测序。就国内规模大的公司有：1、南部测序公司；2,、深圳华大测序公司；3、中部测序公司；4、上海生工测序公司；5、北部测序公司；6、北京三博远志测序公司。同样，这些公司在兰州设有小公司，负责业务的推广，主要跟一些医院和学校合作，主要都在七里河区和城关区。比如甘肃省妇幼保健院、兰州大学第二附属医院、兰州军区兰州总院、兰州市妇幼保健院、甘肃玛丽亚妇科医院、兰州时光妇儿医院。主要负责无创DNA产前检测，还能查类似于唐氏儿的其他染色体病。四、检测类型目前个性化基因测序在临床上的应用主要有两类，一类是针对普通人的疾病筛查，通过测定已知的与某种疾病相关的基因序列位点，来推断其未来罹患该种疾病的概率。比较典型的例子是无创产前DNA检测；另一类是针对癌症等致命性疾病的伴随诊断，通过测定某些特定的基因序列位点（例如：肺癌的KRAS突变和EGFR突变），在一系列的药物或治疗方案中找到对特定患者最为有效的药物或方案。1、常见肿瘤类疾病的检测1）、消化系统食管癌、胃癌、原发性肝癌、胆囊癌、肝外胆管癌、胰腺癌、大肠癌2）、呼吸系统鼻咽癌、喉癌肺癌3）、神经系统神经胶质瘤脑膜癌4）、内分泌系统甲状腺癌5）、五官口腔癌6）、血液系统急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤7）、皮肤—运动系统基底细胞癌、骨肉瘤8）、泌尿生殖系统及乳腺肾癌、膀胱癌、散发性乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌2适用人群：成人3采样标本：外周血五、基因检测机构所需资质：在美国，基因检测市场相对成熟，每个大型城市都会有有资质的基因检测中心，有专门的基因检测医师培养、训练、考试、执照颁发等机构，特别是对于人员、管理、硬件水平、具体操作项目等都分别有相关的资质认证。目前我国没有明确对基因检测的资质做出规范，由于在国内缺乏有效的监管，没有一个类似药品生产的GMP质量认证系统，使得当基因检测市场鱼龙混杂，2007年6月，卫生部印发了《医疗机构临床检验项目目录》，其中明确医疗机构可进行的基因检测项目包括单基因遗传性疾病、大肠癌易感基因的基因检测，家族性乳腺癌基因的基因突变检查，血友病A、B基因突变检查以及一些遗传性疾病的染色体检查等20多项。