胚胎干细胞在GAM基质细胞中定向诱导为造血干细胞

胚胎干细胞在GAM基质细胞中定向诱导为造血干细胞2011210332临床医学（儿科七年制2011级）周康华前言：在胚胎发育过程巾，哺乳动物的造血发生(hematoptfiesis)在可以分为原始造血(primitivehematopoiesis)和确定造血(definitivehematopoiesis)两个生物学过程。原始造血发生于胚外卵黄囊血岛已被普遍认可，长期以来认为永久造血也是超源于胚外卵黄囊，造血中心按发育顺序由卵黄囊转移到肝、脾，并逐渐过渡到骨髓。然而在过去的20多年研究过程中，众多学者的研究成果显示确定造血发生于胚内的主动脉旁胚脏壁(paraanrtiesplandmopleura，P-Sp)／主动脉-性腺-冲肾区(anna．gonad—mesonephrosregion，AGMregion)，而并非起源于胚外卵黄囊(yomsac，YS)。个体发育进程中这两个造血发生过程相互联系非常密切．但其中决定未来终身造血的生理机制尚不清楚。随着胚胎的发育，原始造血被永久的多系造血所取代，确定造血的LTR．HSCs具有自我更新和向髓系、红系、淋巴系多向分化的能力。LTR—HSCs出现在在鼠胎7．5-9．5dpc的PAS和O．5—11．5的AGM区产生，然后迁移至胎肝(fetalliver，FL)大量扩增，在接近出生的时候迁移至骨髓(bonemarrow)并维持出生后个体终生造血。多项研究进一步提示3．4,5多潜能HSC是在AGM区原位产生的，并非来源于卵黄囊。确定造血的发生具有时间和空间的高度限制性，AGM区存在HSCs的时间非常短暂。AGM区为造血发生发育提供了必要的微环境，阐明其作用机制对造血系统发生发育的基础研究及造血干细胞体外工程研究都具有重要意义。摘要：在AGM区基质细胞培养环境中培养含有小鼠胚胎干细胞，得到具有造血功能的造血干细胞，分析造血细胞集落生成能力或将诱导后的HSC移植给放射致死剂量照射的雌性小鼠体内，经尾静脉注射诱导细胞，通过逐日观察动物生存状况、检测性染色体sry基因在受体骨髓中的表达，判断动物存活率和供体细胞造血植入，评价ESC细胞来源的造血重建作用。关键字：GAM区基质细胞、胚胎干细胞、造血干细胞研究证实人AGM区基质细胞对脐血cD34+细胞形成HPP-CFU的能力具有支持作用。为胚胎早期造血发生机制研究提供了了重要的模式细胞和基础资料。=在诱导拟胚体阶段添加BMP-4、VEGF等因子可明显促进中胚层Flk-1+造血前体细胞的形成优势。CFC分析结果显示9～12天的EB细胞可形成红系、粒系集落，但数量较少，且多为二级拟胚体形成基础上的造血样集落。本研究提示BMP4和VEGF因子联合使用可促进中胚层造血前体细胞原始发生。在BMP4+VEGF诱导Flk-1+细胞处于峰值的EB细胞基础上，人AGM区基质细胞能明显提高Sca一1-c-Kit+造血原始细胞的表达(hAGM3、hAGM4组分别可达到13．34±1．89％、1207±2．01％)。体外CFC分析及体内造血重建实验均提示AGM区微环境可能对原始造血细胞存在必要的功能分化修饰作用。多阶段分化结果可见，在AGM区微环境功能可能主要是为了维持一定造血原始细胞的发生数目、维持原始造血细胞的高增殖潜能，并对原始造血细胞可能存在必要的功能修饰作用。这种功能修饰作用对转移胎肝后的造血功能进一步完善可能具有重要的意义。而在AGM体系共培养基础上胎肝和骨髓基质细胞大量扩增了Sca—1+c-Kit+原始造血干细胞，特别是在胎肝水平，扩增效应明显高于AGM饲养层体系。骨髓基质细胞与胎肝的支持扩增作用没有明显差异，但从造血发育迁移的顺序看，FL似乎在机体胚胎发育过程中起着重要的原始干细胞数目的第一步扩增作用，具体机制有待于进一步研究。在各诱导分化阶段，除AGM细胞上细胞尚有一定程度的致瘤作用外，在骨髓或胎肝基质细胞诱导后均未见6周后在SCID小鼠注射部位有肿块形成。成体动物造血重建实验，提示ES细胞来源的HSC能够成功植入并重建小鼠造血功能。EB—AGM—FL诱导组60天存活率最高，为77．8％(7／9)，移植后7天小鼠造血功能开始逐步恢复，在移植后21天基本恢复正常。PCR检测sry基因结果证实ESC来源的供体细胞植入成功。二次重建造血实验显示EB—AGM—FL和EB—AGM—FL—BM两组成活的小鼠骨髓细胞均能重建或参与重建了放射致死剂量受体小鼠造血功能(4／7和2／6)。适当条件下诱导ESC来源的HSC具有重建或参与重建小鼠造血系统的能力，然而具体在初级重建造血实验中的供体细胞植入水平(嵌合率)有待进一步研究。总之，各种诱导分化阶段的造血细胞移植均有一定的造血重建能力。有意义的是在AGM诱导阶段的基础上进一步以胎肝或和骨髓微环境诱导后的细胞造血重建能力最强，且不产生畸胎瘤。结合在AGM共培养基础上进一步以胎肝或和骨髓微环境诱导后的Sca-1+c-Kit+细胞和CFU增多提示AGM诱导体系对原始造血细胞可能存在必要的分化发育的功能修饰。采用EB—AGM—FL和EB—AGM—FL—BM确定造血发育顺序程序化诱导ESC定向造血分化可明显提高造血干细胞的分化效率及其造血重建能力。从另一研究结果可见，类似体内造血发育的动态规律，AGM区微环境主要维持一定造血原始细胞的数目和功能，而胎肝和骨髓基质细胞则大量扩增Sca-1+c-Kit+细胞，特别是在胎肝水平起着重要的第一步扩增作用。AGM区、胎肝和骨髓等发育中造血微环境变化与其造血功能相适应的具体机制有待深入研究。也有胚胎学研究认为，AGM区背主动脉腹侧壁及周围间充质是造血细胞的最早衍生区域，并最初形成了胚内确定造血的原始造血干细胞。造血活动期AGM微环境对造血和血管共同祖细胞Flk-1+细胞部分向HSCs分化提供了重要的细胞接触、细胞外基质及分泌因子等调节信号。研究者进一步将富含Flk-1+前体细胞的EB细胞群，置于含人胚AGM区基质细胞支持层的Transwell共培养体系中，充分模拟胚胎早期造血发生的微环境进一步诱导HSCs形成。流式细胞术结果显示hAGMS3、hAGMS4饲养层组诱导EB分化为Sea-1+c-kit+HSCs的比例及绝对数均较无饲养层组均有显著提高。提示在此非直接接触型共培养体系中，AGM区基质细胞可能通过分泌一些可溶性的调控因子促进造血前体细胞向HSCs分化，并在一定程度上维持HSCs的干细胞性，保持其不分化。造血细胞集落形成分析亦显示AGM基质细胞共培养组细胞可形成红系、粒系和混合系等各系造血集落，初步证明ESCs源性HSCs有多系分化功能。该研究采用中胚层发育调控因子诱导EB前体细胞形成，并进一步以人胚AGM区共培养方法可有效获得较高比例的功能HSCs。寻找AGM区基质细胞产生的与造血分化相关功能分子，将有助于阐明ESCs造血分化的调控机理和进一步优化ESCs造血分化诱导条件。在今后的研究中，拟将通过NOD/SCID小鼠移植模型来进一步证实本研究所诱导产生的原始HSCs的造血重建功能。有一研究在ESCs定向造血分化发育模型基础上，分析了各诱导组获得HSCs在致死剂量辐射小鼠体内的造血重建能力。ESCs来源HSCs在动物体内造血重建能力、动物存活率与移植细胞的数量、诱导条件、受体辐照剂量、移植细胞分选情况有密切关系。Burt等发现经SFC、SCF-3、IL-6等细胞因子诱导EB所形成的细胞，若未经分选经尾静脉输注受鼠可致全部动物死亡，而经骨髓腔注射则有2%-12%的长期存活率，约30%（2/7）受鼠出现畸胎瘤。受鼠接受分选后的c-Kit+CD45+细胞移植则全部获得造血重建和100%的长期存活率（100d）。本研究中诱导的ESCs来源细胞均未经分选，EB+AGM组全部死亡，而EB+AGM+FL组60d存活率77.8%，21d外周血象基本恢复，FCR来源供体细胞成功植入，未见GVHD相应皮肤黏膜改变，接种NOD-SCID小鼠亦无畸胎瘤产生，说明经人AGM区→FL基质细胞诱导后获得的HSCs安全、有效，免疫耐受性好，但具体植入水平有待进一步研究。结论：AGM区微环境可能对原始造血细胞存在必要的功能分化修饰作用，AGM区基质细胞对脐血cD34+细胞形成HPP-CFU的能力具有支持作用，采用EB—AGM—FL和EB—AGM—FL—BM确定造血发育顺序程序化诱导ESC定向造血分化可明显提高造血干细胞的分化效率及其造血重建能力，除AGM细胞上细胞尚有一定程度的致瘤作用外，在骨髓或胎肝基质细胞诱导后均未见6周后在SCID小鼠注射部位有肿块形成。AGM区基质细胞及其微环境在定向分化过程中的作用和作用机制，以及是否有致癌，成瘤发育方向，有待进一步研究。参考文献：1.含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化蔡耘，张绪超，陈惠芹，黄绍良《中国组织工程研究与临床康复》第15卷第27期2011–07–02出版2.含人AGM区基质细胞培养体系定向诱导胚胎干细胞为造血干细胞的实验研究张绪超，陈惠芹，黄绍良，吴北燕，黄永兰，蔡耘《中国病理生理杂志》3.人AGM区基质细胞对脐血CD34+细胞形成HPP．cFu能力的支持作用陈惠芹，张涤华，张绪超《广州医药》20074.人GAM区及胎肝基质细胞促进小鼠胚胎干细胞向造血干细胞分化和体内造血重建蔡耘，张绪超，陈惠芹，吴北燕，黄绍良《中国生理病理杂志》20115.人主动脉-性腺-中肾区基质细胞诱导胚胎干细胞分化为造血干细胞及体内造血重建蔡耘，张绪超，陈惠芹，黄绍良《中国组织工程研究与临床康复》2011.96.人AGM区基质细胞系的建立及其生物学特性陈惠芹;张绪超;黄绍良中山大学学报(医学科学版)2005(01)7.人胚胎AGM区基质细胞在体外培养中对脐血CD34+细胞的支持作用陈惠芹;张绪超;黄绍良[期刊论文]-中华血液学杂志2006(06)8.VerdaL;KimDA;IkeharaSHematopoieticmixedchimerismderivedfromallogeneicembryonicstemcellspreventsautoimmunediabetesmellitusinNODmice[外文期刊]2008(02)9.BurtRK;VerdaL;KimDA;OyamaYLuoKLinkCEmbryonicstemcellsasanalternatemarrowdonorsource:engraftmentwithoutgraft-versus-hostdisease[外文期刊]2004(07)10.FuJR;LiuWL;ZhouYFExpansiveeffectsofaorta-gonad-mesonephros-derivedstromalcellsonhematopoieticstemcellsfromembryonicstemcells[外文期刊]2005(23)