胶乳标记过程中常见问题集

胶乳标记过程中常见问题集1）问题：蛋白无法吸附到微球上。解决方法：加入更多的蛋白；去除微球中的表面活性剂，释放其占据的蛋白结合位点；引入中间物，将微球与蛋白相连；改变缓冲液。2）问题：标记时加入了大量的蛋白，但是仍然无活性。解决方法：改变蛋白加入量，从而改变蛋白与微球结合的空间构象；使用表位稀释物，占据微球上的部分蛋白结合位点，防止蛋白靠的太近。3）问题：清洗去除未吸附蛋白后，微球聚集。解决方法：增加蛋白标记量或封闭剂的用量，防止有空余位点；4）问题：标记后开始活性很好，储存一段时间后，活性降低。解决方法：降低储存温度到2~8度；降低储存液中的封闭剂浓度，防止抗体被替换；确认储存液中无能与抗体竞争的杂质，防止长时间取代抗体。5）PS微球与蛋白（抗体）交联后，当时没发现有凝集，但隔夜后发现有凝集是偶联效率低的原因。当体系蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交联后还空出许多反应基团时，由于这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应，结果是把球又拉在一起了，所以有聚集。可以加一些blockeragents解决,常见的是BSA，另外，也可提高微球的交联率。但为什么是过一段时间后才出现凝集呢，这是因为微球偶联上蛋白后，相互之间由于携带同种电荷的关系，比较稳定（所以能以胶体样存在），只有当偶尔相互碰撞，遇上彼此的反应基团时才能结合。6）抗体偶联至羧基PS球，即时检测效果很好，但置于37度2天后，抗体活性似乎下降很大。可能共价结合未成功，如果是这样，那么最主要的原因是EDAC质量差或过期了。EDAC长期放在空气中会吸潮，水汽会降低EDAC活性。另一个可能原因是凝集。观察胶乳是否有凝集产生。还有，交联蛋白前有没有清洗？我们提供的胶乳缓冲液中含有表面活性剂，可能干扰抗体的结合。如果未发生凝集，而且用前已经清洗，那么我们建议换新的EDAC。7）EDC活化羧基乳胶微球后，加蛋白（抗体）即时有沉淀出现，是什么原因？很多因素可以导致蛋白加入后，微球聚集成块。通常，蛋白偶联前的聚集与缓冲液（电解质）有关。可能是羧基没有活化好。EDC质量出现问题了，请换质量好的再尝试。如果没有好的EDC，可以适当调低活化缓冲液的pH值。对非修饰微球，那么可以从以下方面着手解决：绝大多的微球制备过程中，加有脂肪酸乳化剂。在聚合时，它起乳化作用，在聚合后，它起稳定剂作用，使微球以胶体样分布。在碱性pH下，微球表面的COOH，脂肪酸分子上的COOH以及聚苯乙烯多聚链末端的硫酸根（SO42-）使微球表面带负电荷，亲水性增强，从而能形成稳定的胶体。由缓冲液导致的聚集可以通过加蛋白，阴离子乳化剂，非离子乳化剂（如TritonX-100和Tween-20）。下列方法供参考：a)加入蛋白前，加少量的乳化剂。具体量可以自己摸索掌握，太多的乳化剂可能会占据微球表面，影响蛋白偶联b)少数研究人员选择用含少量蛋白的缓冲液冲洗微球（可以降低体系中的离子强度）c)适当降低缓冲液的浓度，但不能使蛋白变性。d)稀释微球，使微球间距离加大，减少相互结合的机会e)如果有可能，加大偶联蛋白的浓度f)偶联时，将微球加入蛋白液中，而不是将蛋白加入微球中g)偶联时，振荡加快反应总之，其原则是在微球与蛋白偶联前，减少其在高离子强度下与其它微球接触的机会。在偶联结束后，由于微球表面接有的蛋白，会非常稳定。