腰痛宁胶囊药材活性部位不同组合对大鼠软骨细胞的影响_张立国

腰痛宁胶囊药材活性部位不同组合对大鼠软骨细胞的影响张立国1，欧阳霄雯1，吴婷婷1，史万忠2，倪力军1*(1.华东理工大学化学与分子工程学院，上海200237；2.上海中医药大学附属曙光医院，上海200021)［摘要］目的:评价腰痛宁胶囊中各活性部位对白介素1β(IL-1β)诱导大鼠软骨细胞的影响及其相互作用。方法:根据腰痛宁组方原则，将腰痛宁组方药材中的黄酮、皂苷、挥发油(含水提液)、多糖等活性部位依次加入马钱子与麻黄生物碱中，得到6个腰痛宁拆方及全方样品。取7日龄SD大鼠6只，采用Ⅱ型胶原酶消化法分离大鼠软骨细胞，接种24h后随机分空白对照组(含5%小牛血清(FBS)及0.02%吐温-80的DMEM培养基)、模型组(含5%FBS，0.02%吐温-80及10μg·L－1IL-1β的DMEM培养基)及受试药物组(含5%FBS，0.02%吐温-80，10μg·L－1IL-1β及9.77～0.08mg·L－1受试药物的DMEM培养基)，给药48h后用CCK8及亚甲基蓝染色法测定各样品对大鼠软骨细胞增殖及葡萄糖胺聚糖蛋白(GAG)合成的影响。同时采用最小二乘优化方法，计算各样品的半数有效浓度(EC50)叠加值，将其与EC50实验值进行比较，以分析各活性部位间的相互作用关系。结果:较腰痛宁拆方样品，腰痛宁组方及全方在考察浓度范围内均对IL-1β诱导的软骨细胞具有较显著的促增殖及促进GAG合成的作用。各拆方样品中可观察到不同程度的协同、拮抗和叠加作用，其中腰痛宁全方样品中各活性部位间的协同及叠加作用更为显著。结论:药引黄酒可显著提高腰痛宁药材组方对大鼠骨关节炎的治疗作用，显示了腰痛宁处方的合理性及其促进软骨细胞增殖及GAG合成的优势。[关键词]增殖；葡萄糖胺聚糖蛋白；骨关节炎；腰痛宁胶囊；活性部位；黄酒[中图分类号]Ｒ285.5［文献标识码］A［文章编号］1005-9903(2014)10-0151-05[doi]10．13422/j．cnki．syfjx．2014100151EffectandInteractionsofActiveFractionsinYaotongningCapsuleonChondrocytesinＲatinvitroZHANGLi-guo1，OUYANGXiao-wen1，WUTing-ting1，SHIWan-zhong2，NILi-jun1*(1.SchoolofChemistryandMolecularEngineering，EastChinaUniversityofScienceandTechnology，Shanghai200237，China；2.ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shanghai200021，China)［Abstract］Objective:ToevaluatetheinvitroeffectsandinteractionsofactivefractionsinYaotongningcapsule(YTNC)byutilizinginterleukin-1β(IL-1β)activatedchondrocytes．Method:Sixsampleswerepreparedbymixingdifferentactivefractionsincludingalkaloids，flavonoids，saponins，volatileoil，hydrousextractandpolysaccharidesaccordingtotheformulatingprincipleandtheratioofmaterialsinYTNC．Chondrocyteswereobtainedfromsixseven-dayratsusingcollagenaseII，beforetheyweredividedintothreegroups:controlgroup(Dulbecco'smodificationofEagle'smediumDulbecco(DMEM)containing5%fetalbovineserum(FBS)and0.02%Tween-80)，modelgroup(DMEMcontaining5%FBS，0.02%Tween-80and10μg·L－1IL-1β)andsamplegroup(DMEMcontaining5%FBS，0.02%Tween-80，10μg·L－1IL-1βand9.77-0.08mg·L-1samples)．After48h，theproliferationsofchondrocyteswereexaminedthroughcellcountingkit-8(CCK8)assay，whentheintracellularlevelofglycosaminoglycan(GAG)wasdetectedby1，9-dimethylmethylenebluestainingusingaglycosaminoglycans(GAG)assaykit．AquantitativeevaluationmethodwasexertedtoinvestigatetheeffectofeachsampleonIL-1βactivatedchondrocytes．Ｒesult:ThecomparisonofEC50ofYTNCsampleanditspartialprescriptionsindicatedthatYTNCprescriptionhadthemostsignificanttherapeuticeffectonpromotingproliferationandGAGsynthesisinchondrocytes．Synergistic，antagonisticandadditiveactionallcouldbeobservedfollowedbyaddingalkaloids，flavonoids，saponins，volatileoil，hydrousextractandpolysaccharidestoeachpartialprescription．SynergisticandadditiveeffectsbetweenactivefractionsinYTNCprescriptionwereobserved，respectively．Conclusion:Thetherapeuticeffectonosteoarthritis(OA)ofYTNCwithoutChinesericewinewasobviouslyimprovedaftertheadditionofChinesericewine，whichindicatedthatthecombinationofactivefractionsinYTNCwasreasonable．[Keywords］proliferation；glycosaminoglycans；osteoarthritis；Yaotongningcapsule；activefractions；Chinesericewine骨关节炎(osteoarthritis，OA)是最常见的一种退行性关节疾病，其发病机制十分复杂［1］，迄今没有特别有效的药物治疗手段［2］。目前西医主要以非甾体类抗炎药缓解症状，往往会带来明显的胃肠道毒副作用，而中医药在治疗OA疗效良好，毒副反应小［3-4］。腰痛宁胶囊以马钱子为君药，并与麻黄、甘草、苍术、乳香、没药、川牛膝及土鳖虫、全蝎、僵蚕9味药材，按照一定比例打粉制成胶囊，伴以黄酒吞服，已有几十年临床治疗腰椎间盘突出等症［5］的历史。最近临床研究发现，腰痛宁对骨性关节炎也有疗效［6］，但腰痛宁中的多药材及多成分使得其现代药理研究难以深入。近年有学者对由2～3种药材的提取物或几种活性成分不同组合构成的中药样品进行细胞水平药理学研究，揭示了不同配伍所产生的协同、拮抗作用［7］，为现代中药药理研究提供了新的途径。但相关研究只是根据测试数据的显著性差异分析来评估样品的活性，而缺乏半数有效浓度(EC50)这样的定量评价，样品的真实活性易被掩盖；而几种活性成分的组合难以体现实际中药复方的物质组成。本文以腰痛宁组方药材的活性部位为基础，根据各原料药材在腰痛宁组方中的重要性并借鉴组合化学思想，构造了以马钱子与麻黄生物碱为主、其他9味药材的黄酮、皂苷、挥发油(水提物)、多糖等活性部位为辅的6个腰痛宁拆方及全方样品，以软骨细胞增殖情况及细胞内葡糖胺聚糖蛋白(glycosaminoglycans，GAG)合成水平作为评价指标，比较各样品在该模型中的EC50值，量化考察各腰痛宁活性部位在不同组合的OA治疗作用与其相互影响，探究腰痛宁处方的药效物质基础及其作用机制。1材料1.1动物6只健康清洁级SD大鼠，7日龄，雌雄各半，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号SCXK(沪)2008-0016。1.2试剂PBS片剂(MedicagoAB，批号173106)，大鼠白介素-1β(IL-1β)，Prospec，批号Cyt-394-b)，小牛血清(Gibco，批号619559)，0.25%胰酶(批号S09990L0931)，两性霉素(批号S08498L0009)，双抗(批号S09965L0022)及DMEM高糖培养基(批号S09971L0103)由美国Biowest公司提供，Ⅱ型胶原酶(批号C6885-100mg)，木瓜蛋白酶(批号P3125，SLBC212V)，乙酸钠(批号S2889，SLBD4179V)，EDTA二钠盐(批号C5134，SLBFT102V)及半胱氨酸盐酸盐(批号C1276，BCBH6387V)购自美国Sigma公司上海分公司，CCK8试剂盒(批号ES781)及葡萄糖胺聚糖蛋白(GAG)检测试剂盒(批号B3000，JK43)分别购自日本同仁化学和英国Biocolor公司。1.3仪器ML104型分析天平(德国MetterToledo公司)，QL-901型漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，S10-3型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)，DS-3510DTH型超声仪(上海生析超声仪器有限公司)，CELL150型CO2培养箱(Thermo)，CKX41型倒置显微镜(Olympus)，TDZ4-WS型离心机(湖南赛特湘仪)，CLASSⅡ型生物安全柜(LABCONCO)，EL-340型酶标仪(Bioteck)，DK-S26型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，TS-1型脱色摇床(江苏海门市其林贝尔仪器制造公司)。1.4药材及样品制马钱子(批号Y302-09091-10)、苍术(批号Y002-101001-2)、麻黄(批号Y412-100601-12)、土鳖虫(批号Y803-110101-5)、川牛膝(批号Y012-110401-1)、僵蚕(批号Y805-1011054)、甘草(批号Y013-110301-1)、乳香(批号110301-2)、没药(批号110401-1)、全蝎(批号Y804-11302-4)、黄酒(批号291110)均由承德颈复康药业集团有限公司提供，经该公司执业药师王春民鉴定(表1)，样本保存于华东理工大学化学与分子工程学院分析化学实验室。各中药活性部位由本实验室自行提取、配制。根据腰痛宁组方原则及组合化学理念按照表2构造腰痛宁拆方及组方样品，以保证每个活性部位至少被评价一次。马钱子及麻黄生物碱作为腰痛宁中君药及较主要成分所对应的活性部位，出现在每个样品组合中并进行反复评价。其他活性部位则按照各药材在腰痛宁组方中的功效及其重要性，按黄酮、皂苷、挥发油(水提物)及多糖的顺序依次分别叠加。表2列出了所设计的样品组合，各样品中所含的生物碱类、黄酮类、皂苷类、挥发油类(含水提液)和多糖类活性部位的配比均按照腰痛宁胶囊中各药材的投料比例混合而成，样品I到样品VI为以上五大