致泻性大肠埃希氏菌PCR多重检测方法建立

致泻性大肠埃希氏菌PCR多重检测方法建立目前国内检测致泻大肠埃希氏菌的现行有效方法是GB/T4789.6-2003，该方法主要从分离培养、生化试验、血清学试验和肠毒素试验对致泻性大肠埃希氏菌进行鉴定，本方法虽然不需要贵重仪器设备、费用低，但是耗时较长，实验所用的试剂不易买到，实验过程干扰因素较多。由于该类菌与普通大肠埃希氏菌生化反应相似，在分离平板上菌落形态近似，因此从平板上反应上挑取可疑菌落就很困难，只有多挑取可疑菌落进行下一步的鉴定才能增加样品中检出致泻性大肠埃希氏菌的几率。而多挑取菌落进行鉴定又增加了人力物力的消耗。由于致泻性大肠埃希氏菌包含5种，因此对挑取的单个菌落要同时进行EPEC,ETEC,EIEC,EHEC和EAEC的检测，半轴繁琐，复杂。分子生物学尤其是PCR方法以其快速、简便，灵敏度高，特异性强等特点，越来越多的应用于病原体毒力基因的检测，而大肠埃希氏菌的致泻性主要取决于是否携带相应的独立因子，因此该技术特别是多重PCR技术特别适合于5种致泻大肠埃希氏菌多种毒力基因的检测。多重PCR技术，可以在一个反应体系中进行多个目的基因片段的PCR扩增，快速获得致病菌种属、型别和毒力基因的扩增结果。美国早在2008版BAM上将PCR检测技术应用到致泻性大肠埃希氏菌的鉴定。近年来，许多学者进行了该方面的研究，但仅限于一种致泻大肠的毒力基因和种属基因的检测，而同时对五种致泻大肠埃希氏菌进行鉴定的多重PCR试剂盒未见报道。天津生物芯片开发的五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒通过同步扩增致泻性杆菌菌典型毒力基因，快速实现对EPEC/EHEC/ETEC/EIEC/EAEC等五种致泻性大肠埃希氏菌的型别划分和鉴定。【预期用途】用于食品、饮用水、临床样品以及环境样品中的五种致泻性大肠杆菌（EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC）的分型检测。【检验原理】五种致泻性大肠杆菌（EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC）共含有11种毒力基因，针对这11种毒力基因，试剂盒使用11对特异引物，与样本中基因组的相应靶位点特异性结合，PCR反应后，不同类型的样本产生不同的扩增片段，从而达到对五种致泻性大肠杆菌快速分型检测的目的。【主要组成部分】五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒组分规格数量贮存核酸提取液1mL/支2支-20℃PCR反应液600ul/支1支Taq酶12ul/支1支阳性对照品100ul/支1支阴性对照品100ul/支1支【储藏条件及有效期】-20℃保存，避免反复冻融，有效期一年。【适用仪器】普通PCR仪【样品处理】（1）取培养后的菌液约1.5ml，12000rpm离心2min，去上清。（2）加入200μl无菌水，充分混匀，12000rpm离心2min，去上清。（3）加入80μl裂解液，用移液器吹吸混匀，50℃水浴1小时，100℃水浴15分钟，冰上放置10分钟后12000rpm离心3min。（4）取上清液用于PCR检测。【使用方法】1.试剂配制（试剂准备区）从试剂盒中取出PCR反应液在室温融化，将PCR反应液充分震荡混匀，所有试剂在使用前2000rpm离心10s。设所需要的管数n（n=样本数+1管阴性对照品），每个测试反应体系试剂配置如下表。计算所需要的n管反应的各试剂的使用量，加入至适当体积的无菌离心管中，充分混合均匀，分装至无菌PCR反应管中，每管24μl。PCR反应液Taq酶每个反应体系试剂用量23.5μl0.5μl2.PCR扩增（扩增和产物分析区）将样本、阴性对照品使用前恢复至室温，2000rpm离心10s。向每个PCR反应管中分别加入样本、阴性对照品各1μl，震荡混匀，于2000rpm离心10s。将PCR管放入PCR仪中，使用以下程序进行扩增反应，整个扩增反应约需2小时：Step194℃5minStep294℃30sStep363℃30s30个循环Step472℃90sStep572℃5min3.结果判断（扩增和产物分析区）从PCR管中取出2μlPCR产物与9μl阳性对照品一起进行浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下阳性对照品从上至下应有11条带，分别为1487bp、1111bp、910bp、766bp、655bp、544bp、400bp、324bp、244bp、171bp和102bp。样品观察到1487bp、910bp、544bp条带即为毒力基因uidA、bfpB和escV阳性，即为典型EPEC菌株。观察到1487bp、544bp、324bp、244bp条带即为毒力基因uidA、escV、stx2A和stx1A阳性，即为典型的EHEC菌株。观察到1487bp、655bp和171bp条带即为毒力基因uidA、elt和estlb阳性，即为典型的ETEC菌株。观察到1487bp和766bp条带即为毒力基因uidA和invE阳性，即为典型的EIEC菌株。观察到1487bp、1111bp、400bp和102bp条带即为毒力基因uidA、pic、aggR和astA阳性，即为典型的EAEC菌株。阴性对照品结果应为阴性。【注意事项】1.实验前请仔细阅读本说明书。2.本试剂盒不做临床诊断。3.实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，试验人员必须进行专业培训，实验过程中严格分区进行（试剂准备区、样本制备区、扩增和产物分析区），实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区用品不能交叉使用。4.样本准备和试剂准备阶段应使用生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器。5.对每次实验进行质量控制。6.试剂使用前要完全解冻，并混合均匀，但应避免反复冻融。7.样本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃。8.实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器。9.所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。