细胞工程6原生质体培养和植物体细胞杂交

CELLENGINEERING细胞工程课程初步安排：36学时第一章绪论4个学时第二章实验室配置及基本技术2个学时第三章植物细胞工程的理论基础4个学时第四章植物组织器官培养技术6个学时第五章植物细胞培养及次生代谢产物生产3个学时第六章原生质体培养和体细胞杂交3个学时第七章人工种子1个学时第八章植物种质资源离体超低温保存1个学时第九章动物组织培养3个学时第十章动物细胞融合与单克隆抗体4个学时第十一章动物组织与胚胎工程1个学时第十二章试管动物与克隆动物2个学时第六章原生质体培养和植物体细胞杂交原生质体的概念植物原生质体（protoplast）是指除去了细胞壁后的裸露的球形细胞。原生质体能进行植物细胞的各种基本生命活动，如蛋白质和核酸合成、光合作用、呼吸作用以及通过质膜的物质交换等，这极有利于探讨许多细胞生理问题。同时，由于原生质体在诱导条件下能发生融合，离体培养条件下可能再生植株。因此原生质体培养研究在理论上和实践上都具有重要意义。原生质体培养的基本原理原生质体培养的发展历程：-1880年，Hanstein首次使用原生质体protoplast一词-1960年，Cocking首次采用纤维素酶从番茄幼苗的根尖中分离原生质体获得成功-1971年，Takebe等首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株-1985年，Fujimura等获得第一例禾谷类作物－-水稻原生质体培养再生植株-1986年，Spangenberg等利用单个原生质体培养再生植株，在甘蓝型油菜上获得成功据统计，自1971年Takebe首次报道从烟草叶肉原生质体再生植株后，已有49个科160多个属的360多种植物经原生质体培养得到了再生植株。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但已开始从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。原生质体的制备优点：条件温和，原生质体完整性好，得率高等。（一）原生质体的分离--酶解法影响因素：供试材料，酶的种类、浓度以及其组合，酶液渗透压，酶解时间和温度，纯化方法1、材料的来源实践证明，幼嫩叶片，萌发种子的下胚轴、子叶以及愈伤组织和悬浮培养物等均是原生质体的良好来源：--叶肉细胞是分离原生质体的较好材料，从叶片中可分离出大量的较均匀一致的原生质体。由叶片制备原生质体时，植株的年龄和生长条件十分重要一般选用植株上充分展开的叶片；--愈伤组织和悬浮细胞系，由于其生长快速稳定，受环境条件的影响不大容易获得大量高质量的原生质体。细胞系建立时间的长短，继代培养的时间和培养基的成分等都影响原生质体分离的数量和质量。一般选用结构疏松并处于对数生长期的细胞分离原生质体的效果较好。外植体材料用黑暗处理、低温处理和不同光质照射以及预培养等方法，可以提高某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处理方法不同：--龙胆试管苗只有用4℃处理后分离的原生质体才能分裂；--甘蔗植株只有在黑暗条件下培养12小时后分离的原生质体才能分裂；--马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48小时后分离原生质体，才会获得较高的原生质体产量。2、预处理及酶解酶酶解渗透压调节剂酶来源生产厂家纤维素酶类onozukaR–10绿色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin绿色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan果胶酶类MacerozymeR-10根霉YakyltHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase根霉SigmaChemicalCo.,St.Louit,MO63178,USAPectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纤维素酶RhozymeHP-150黑曲霉RohmandHassCo.,Philadelphia,PA19105,USAHemicellulase根霉SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO63178,USA原生质体分离常用的商品酶甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等--调节酶液渗透压，使其与所处理细胞的渗透压相似，保证原生质体活力，使用浓度根据植物材料而异，一般在0.2~0.8mol/LCaCl2·2H2O，KH2PO4，MES（2-氮吗啉乙烷磺酸），葡聚糖硫酸钾--提高原生质体膜的稳定性AgNO3、过氧化物歧化酶(SOD)--减轻酶解时产生的乙烯、氧自由基对细胞膜的损伤牛血清蛋白--可防止细胞壁降解过程中对细胞膜和细胞器的破坏酶解时间酶浓度酶解温度利用尽可能低的酶浓度和尽可能短的酶解时间获得大量而有活力的原生质体！酶解过程一般为将酶解材料放入装有酶液的培养皿中进行酶解，或在静止条件下每隔一段时间轻轻摇动，或将培养皿放在30～50r/min的摇床上轻轻振荡以游离原生质体。应注意以下条件：a、植物材料应按比例和酶液混合，才能有效地游离原生质体b、不同材料其生理特性不同，对酶液中渗透压的要求也不同c、酶的种类、浓度和酶解时间因材料而异d、酶液pH值一般在5.4～6.0e、酶解温度控制在24～28℃左右f、黑暗或弱光下进行（二）原生质体的纯化因植物材料和所使用的渗透压稳定剂不同，进一步纯化方法有：1、沉降法2、漂浮法3、梯度离心法沉降法方法：将收集的滤液低速离心，使原生质体沉降于管底。转速的控制以将原生质体沉淀而细胞碎片等杂质仍悬浮在上清液中为准，一般为500～800r/m下离心3～5min。用吸管小心地吸取上清液，再用洗涤液洗原生质体3次，最后用培养基洗涤1次，调整到一定密度后进行培养。--纯化收集方便，操作简单，原生质体丢失少。--在漂洗过程中容易造成原生质体的损伤，并且纯度不够好，存在少量脱壁不完全的细胞和破碎的原生质体。漂浮法方法：将收集的滤液于1000r/m的转速下离心10min，原生质体将漂浮于溶液的表面，细胞碎片等杂质将下沉到管底。用吸管吸出原生质体并转入到另一离心管中，反复3次，用培养基洗涤1次后调整到所需密度进行培养。--可以收集到较为纯净的原生质体，并且可以避免在离心纯化过程中因振荡撞击或挤压引起的原生质体破裂或损伤。--原生质体在数量上损失较多。界面法－梯度离心法方法：采用两种比重不同的溶液，离心后使完整无损的原生质体处在两液相的界面之间,而细胞碎片等杂质沉于管底。用此法可获得更为纯净的原生质体。以柑桔为例：25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液（三）原生质体活力的测定1.荧光素双醋酸酯(FAD)染色法2.酚藏花红染色法3.荧光增白剂染色法4.伊凡蓝染色法二乙酸荧光素(fluoresceindiacetate,FDA)染色法FDA本身无荧光，无极性，能透过细胞质膜，一旦进入原生质体后能在内酯酶作用下分解形成有荧光的极性物质－荧光素荧光素不能自由穿越细胞质膜而积累在原生质体当中，在荧光显微镜下观察时，凡发淡绿色荧光的是有活力的原生质体，无荧光或荧光很微弱的已经死亡或活力低的原生质体。原生质体的培养原生质体培养基原生质体培养方法愈伤组织形成和植株再生影响原生质体培养的因素1.无机盐大量元素浓度；NO3-与NH4+的比例；Ca2+浓度2.有机成分维生素、氨基酸、糖及糖醇、酵母提取物、水解酪蛋白3.激素：生长素先高到低4.渗透压：培养基渗透压和细胞渗透压等渗原生质体培养基液体浅层培养过程：将原生质体以一定密度悬浮在培养液中，用吸管将原生质体悬浮液转移到培养皿或三角瓶中使成一薄层。膜密封后置于人工培养箱中，静置培养。优点：操作简便，对原生质体伤害小，通气性好，代谢物易扩散易于补充新鲜培养基，形成细胞团或小愈伤组织后易于转移，较广泛采用。缺点：原生质体在培养基中分布不均匀，常发生原生质体间的黏连现象或造成局部密度过高，从而影响原生质体再生细胞的进一步发育，并且难以定点观察和跟踪单个原生质体的生长发育过程。固体培养－－琼脂（糖）平板培养或包埋培养过程：将原生质体悬浮液与35℃的琼脂（糖）培养基等量混合，使琼脂（糖）最终浓度为0.6%左右，迅速并轻轻摇动使原生质体均匀分布，然后转移至培养皿，冷却后原生质体包埋在琼（糖）培养基中，封口后培养。优点：原生质体被彼此分开并固定位置，便于定点观察，跟踪单个原生质体发育过程，易于统计原生质体的分裂频率和植板率；同时避免了细胞间有害代谢产物的影响。缺点：对操作要求较严，在原生质体悬浮液与琼脂（糖）培养基混合时温度必须合适，太高会影响原生质体活力，太低培养基的凝固较快使得原生质体分布不均匀；并且原生质体的生长发育比液体浅层法慢。已较少采用。液体浅层-固体平板双层培养法过程：在培养皿的底部铺一薄层含琼脂（糖）的固体培养基，再将原生质体悬浮液加于固体培养基表面进行液体浅层培养。优点：固体培养基中的营养成分可以缓慢地释放到液体培养基中，补充培养物对营养的消耗。同时，如在下层培养基中添加一定量的活性炭，可有效地吸附培养物产生的有害物质，促进原生质体的分裂及细胞团的形成。缺点：不易观察细胞的发育过程。琼脂糖珠培养过程：将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后，向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。优点：可通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于原生质体进一步生长和发育。由于改变了培养物的通气和营养环境，从而可促进原生质体的分裂及细胞团的形成。饲养层培养-看护培养、滋养培养过程：该法又可分为分层培养和混合培养。分层培养是先制备固体的饲养细胞层，再在其上植板培养层。用x射线照射部分分离的原生质体，照射后将原生质体洗2～3次，包埋于琼脂培养基中，然后铺于培养皿的底层构成饲养细胞层。将欲培养的有活力的原生质体植板于饲养细胞层上面进行培养。混合培养是将经过x射线照射而失去分裂能力的原生质体与有活力的原生质体相混合，并包埋于琼脂培养基中进行固体平板法培养。优点：适合于原生质体低密度培养和某些难以培养的植物原生质体的培养。培养条件主要指培养的光照和温度。原生质体培养对培养条件的要求十分严格，且不同来源的原生质体在不同的培养阶段有不同要求。一般来说：--新分离原生质体应在散射光或黑暗中培养，诱导分化阶段再置于光下培养，光强1000～3000lx，光周期每天10～16h--不同的植物原生质体培养对温度的要求不尽相同，一般为25～30℃细胞壁再生细胞分裂愈伤组织形成植株再生愈伤组织形成和植株再生--原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。--电镜观察发现，原生质体培养数小时后新壁开始形成，先是由质膜合成形成细胞壁的主要成分微纤维，然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多片层的结构，以后在质膜与片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。(1)细胞壁再生--原生质体一般培养2～7d后开始第一次分裂，此时间随植物的种类、分离原生质体的材料、原生质体的质量、培养基的成分和培养条件而异。--用幼苗的下胚轴和子叶、幼根、悬浮培养的细胞和未成熟种子的子叶等为材料分离的原生质体，一般比用叶肉分离的原生质体容易诱导分裂，第一次分裂出现的时间较快。(2)细胞分裂和生长--大多数情况下，原生质体培养二周后形成多细胞细胞团，三周后形成肉眼可见的小细胞克隆，大约六周后形成直径1mm的小愈伤组织。--原生质体培养7～10天后必需及时添加新鲜培养基，否则形成的细胞团不继续生长，待小愈伤组织长至1mm左右时应及时转移到固体培养基上使其进一步生长。(3)愈伤组织的形成--原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化培养基上可进一步成苗。越来越多实验证明，两步成苗法更适合大多数植物原生质体再生植株。即，首先将愈伤组织培养于低浓度生长素培养基上，让其增殖和调整状态再转移到分化培养基上分化成苗。(4)植株再生基因型原生质体的来源起始培养密度和培养基影响原生质体培养的因素植物原生质体培养程序示意图原生质体分离⑴机械法分离原生质体⑵酶法分离⑶影响原生质体活力的因素原生质体纯化⑴沉降