花卉植物组织培养技术研究

花卉植物组织培养技术学院：专业：姓名：学号：花卉的组织培养作者：迎彬、陈学政、卢文、王静、李振致淄博师专学2011第1期总第23期吊兰又称垂盆草、桂兰、钩兰、折鹤兰,西欧又叫蜘蛛草或飞机草,原产于南非,百合科多年生常绿草本植物。根肉质,叶细长,似兰花。叶簇生,似花朵,四季常绿,是著名的观叶花卉,被人们誉之为“空中花卉”。一、实验材料1.初代培养:选用一年生生长健壮无病害吊兰带芽茎段作外植体。材料来源是生物实验室吊兰。2.继代培养:初代培养后诱导出的胚性愈伤组织及丛芽。由于时间和实验室条件限制,我们直接将初代培养的吊兰丛芽转移到新的生根培养基进行生根培养。3.生根培养:各个初代培养试验中生长健壮的无根苗。4.移栽试验:生根培养和培养中长出根和茎的健壮幼苗。5.其它供试材料:萘乙酸(NAA)为分析纯级,中国医药(集团)上海化学试剂公司生产,有效成分≥99.0%;6-苄基腺嘌呤(6-BA)(分析纯),为中国医药(集团)上海化学试剂公司生产,有效成分98.0%;凝固剂用琼脂粉(化学纯),为上海SCRC国药集团化学试剂有限公司生产的琼脂粉(凝胶强度≥400)。糖为天津市化学试剂一厂生产的蔗糖(化学纯)。二、试验方法1.外植体的选取:带芽茎段选取健壮无病虫害幼茎为外植体,然后从盆栽母株中分割出当年长出的新生分株,从茎尖开始,在超净工作台上割为1cm长的茎段作为初代培养的外植体进行培养。2.初代培养:吊兰带芽茎段培养试验从无病虫害的盆栽母株中分割出当年长出的新生分株,用自来水冲洗干净,除去根及下部老化组织,小心剥去外面老叶(注意不要弄伤腋芽),然后在顶芽以上横切,去除叶片。先在实验室用洗衣粉液浸泡5min,后用不间断自来水冲洗10min。在超净工作台上,再从基部开始切为1cm长作为外植体(带有芽体的)。去掉没有芽体的茎段后,用75%酒精浸30秒,无菌水冲洗一次。再用10%NaClO浸泡,灭菌时间分别10min,然后用无菌水冲洗5～8次,接种到培养基上。培养7d后,统计污染率。一个月后统计分化率。3.生根试验：将生长健壮的无根苗单株切下,接到各生根培养基中。每个星期记录生根和整个植株的生长发育情况。4.小苗移栽试验将长出根的小苗放在阴棚中炼苗,一段时间后,洗净组培苗上面的培养基,假植到沙床上,浇透水,盖上薄膜,一星期后揭膜。7d后统计假植成活率,20d后移栽到花盆或大田。三、实验处理1.基本培养基基本培养基为MS,初代培养基和增殖培养基附加糖3%,琼脂0.5%;生根培养基不加说明的都用1/2MS附加糖6%,琼脂0.5%;配加不同浓度的激素;PH值为5.8～6.0。2.各阶段的培养基(1)吊兰茎段初代培养MS+6-BA1.0～3.0(单位为mg/L,下同)十NAA0.1～0.5,共9种培养基,分别为:MS+6-BA1.0+NAA0.1;MS+6-BA1.0+NAA0.2;MS+6-BA1.0+NAA0.5;MS+6-BA2.0+NAA0.1;MS+6-BA2.0+NAA0.2;MS+6-BA2.0+NAA0.5;MS+6-BA3.0+NAA0.1;MS+6-BA3.0+NAA0.2;MS+6-BA3.0+NAA0.5。(2)不定芽增殖培养MS+6-BA0.5～3.0(单位为mg/L,下同)十NAA0.1～0.5,共12种培养基,分别为:MS+6-BA0.5+NAA0.1;MS+6-BA0.5+NAA0.2;MS+6-BA0.5+NAA0.5;MS+6-BA1.0+NAA0.1;MS+6-BA1.0+NAA0.2;MS+6-BA1.0+NAA0.5;MS+6-BA2.0+NAA0.1;MS+6-BA2.0+NAA0.2;MS+6-BA2.0+NAA0.5;MS+6-BA3.0+NAA0.1;MS+6-BA3.0+NAA0.2;MS+6-BA3.0+NAA0.5。(3)生根试验①糖浓度对无菌苗生根的影响设5个浓度梯度:1/2MS+糖3%+NAA0.8;1/2MS+糖5%+NAAO.8;1/2MS+糖6%+NAAO.8;1/2MS+糖9%+NAAO.8;1/2MS+糖10%+NAA0.8。②大量元素浓度对无菌苗生根的影响设四个浓度梯度:1/4MS+糖6%+NAAO.8;1/2MS+糖6%+NAAO.8;3/4MS+糖6%+NAAO.8;MS+糖6%+NAAO.8。3.培养基的灭菌所有培养基均在1.1kg/cm2,121℃饱和蒸汽压下灭菌20min。四、培养条件培养室温度为22℃～28℃,每天光照12h,光照强度1600～2000Lx。五、结果与分析(一)无性培养系的建立1.外植体灭菌效果根据吊兰茎段的老嫩情况和受环境污染情况,将选取的材料在10%NaClO中分别浸泡8、9、10、15min,再过7d后统计污染的情况,见表1。从表1中可以看出,茎段外植体的灭菌效果均随着灭菌时间的延长,污染率有所下降。对比四种灭菌时间长度灭菌15min时,灭菌效果最好,污染率为15.4%;其次是灭菌10min时,污染率为17.6%;灭菌8min时的污染率最高,其污染率为30.1%。需要说明的是,NaClO是一种较好的表面灭菌剂,它可以释放出活性氯离子杀死细菌,并且易分解,无残留,其碱性很强,处理时间过长会对植物组织有一定的破坏作用。在此实验中我们选择了用NaClO处理10min。2.不同浓度6-BA与NAA配比对吊兰茎段分化的影响接种7d左右,茎段绿色转深。培养12～15d时,外植体的切口边缘及附近出现一些淡黄色圆粒状突起,这些突起继续生长约15d后直接形成不定芽。表2初代培养———不同浓度6-BA与NAA配比对外植体叶芽的分化的影响注:基本培养基为MS。在吊兰的初代培养中,带芽外植体虽然能够合成一定数量的细胞分裂素。但由于数量不足,外源的细胞分裂素6-BA对建立不定芽的分化是必须的。数据显示:最佳生芽培养基是MS+6-BA2.0(单位:mg/L,下同)+NAA0.1配比的培养基上分化率及分化系数最高,分别为69.2%和3.1,芽长势最好。同时,6-BA对诱导不定芽分化有明显促进作用。(二)生根培养1.糖浓度对吊兰生根培养的影响无根芽转移到生根培养基上,7d后开始生根,15d后全部生根,连续培养45d后统计生根率,如下表3。表3糖浓度对吊兰生根的影响从试验结果看出:吊兰的根的分化能力极强,在45d后,其无根苗的根的分化率全部达到100%。并且,随着糖的浓度的增加,无根芽的平均生根数总体上显示上升趋势。这说明在一定范围内,糖对根的分化起到了促进作用,并且随着糖的浓度增大,植物根的数量就越多。2.大量元素对吊兰生根的影晌大量元素对吊兰生根的影响结果,如下表4数据显示。我们认为,大量元素过少(1/4MS+糖6%+NAAO.8),会引起根的分化率变低;大量元素过高(MS+糖6%+NAAO.8),对根的分化也会起到抑制作用。吊兰的无根芽进行生根分化的最佳培养基是1/2MS+糖6%+NAAO.8。表4大量元素对吊兰生根的影响注:附加糖6%,NAA0.8。吊兰无根苗的生根培养要诱导其生根,必须选择合适的生根培养基。表3和表4的数据表明,在我们设计的培养基中,以1/2MS+糖10%+NAA0.8配比的培养基为最佳,无根芽的生根率最高。吊兰生根与很多因素有关,其中糖浓度和大量元素浓度都可以影响其生根。(三)移栽移栽是组培苗生产中重要的步骤之一。组培苗长期在全营养、高湿度、适合的温度和光照条件中生长,生长环境较优越;试管苗对自然环境的适应能力极差,直接从培养容器转入田间,很难成活。我们必须在移栽到大田以前,先人为创造出一种与移栽后生长条件相似的环境进行一段时间的适应,这有利于提高移栽的成活率。在吊兰组培苗的移栽中,主要分几步完成:1.沙床的准备:沙床用沙:土=7:3混合成,提前一个星期用1～2‰的高锰酸钾溶液浇灌灭菌消毒,并用薄膜将其封住,进行灭菌。2.炼苗:生根培养的瓶苗培养两个半月左右,置于无强烈直射光的阴棚里进行炼苗,为移栽试管苗进一步适应外界环境创造条件。3.假植:炼苗一个星期后,将苗从瓶内取出,洗干净附着在上面的培养基(注意不要弄伤根部),假植在沙床上。种完后,适当浇水,盖上薄膜,注意此时光照不要太强烈,要植物有一个慢慢适应的过程。三、小结与讨论(一)小结1.外植体灭菌效果:外植体灭菌有很多种方法,我们实验中主要采用的是NaClO灭菌的方法。大量的实验表明,利用升汞0.1%(HgCl2)10min进行灭菌效果更好,考虑到升汞是含有剧毒的重金属盐杀菌剂,我们初步建立的组培实验室没有相应的危险化学药品处理系统,所以在组培中尽量避免使用剧毒品进行灭菌。在使用Na-ClO对外植体进行灭菌处理时,随着时间的延长,灭菌效果越好。由于NaClO是碱性物质,长时间处理会对外植体有毒害作用。综合考虑后,我们在试验中选择10%NaClO处理10min,取得比较好的灭菌效果。植物组培灭菌方法的选择,要考虑外植体污染率的问题,还要考虑环境污染和材料的后期培养问题,是一个需要综合考虑的关键性问题。2.无性培养系建立:用带芽吊兰茎段作为外植体接种到各种培养基中进行培养,试验结果表明,在所试验的培养基中,最佳生芽培养基是MS+6-BA2.0(单位:mg/L,)+NAA0.1配比的培养基上分化率及分化系数最高,分别为69.2%和3.1,芽长势最好,叶色青绿。在试验中,我们看到,植物激素6-BA主要是促进芽的分化的作用[1](P58-63),NAA主要促进根的生长和分化,在生芽试验中,NAA含量过高,会明显抑制植物花芽的分化。3.胚性愈伤组织和不定芽增殖及分化:在这一部分,我们设定了培养基,考虑到条件的限制,并且对后续实验没有影响,暂时没有进行这一步骤,我们希望在后续研究中进行试验。4.生根培养:在生根培养中,糖有助于吊兰的生根。[2](P72-76)大量元素过少(1/4MS+糖6%+NAAO.8),会引起根的分率变低;大量元素过高(MS+糖6%+NAAO.8),对根的分化也会起到抑制作用[3](P94-102)。吊兰的无根芽进行生根分化的最佳培养基是1/2MS+糖6%+NAAO.8。二)讨论1.吊兰组培外植体的选择:吊兰培养过程可选择的外植体很多,可以选择叶片、茎尖、茎段或花器官材料的部位[4]。选择外植体,关键要看其取材的方便性、材料数量的多少、材料的部位生理状态、发育阶段及取材时间是否有利于在初代培养中愈伤组织或不定芽的诱导,外植体的选择是初代培养成功与否的关键因素。吕复兵(2004.10)等对马达加斯加吊兰的组织培养和快速繁殖进行研究后认为,单个的腋芽和顶芽,在培养过程中易褐变和出现水浸状而死亡,存活率低。即使能存活,芽萌发的诱导期也较长;而整个带芽茎段的抗褐化和水浸状危害的能力较强,排除污染因素,存活率达100%,且芽萌发的诱导期较短[5]。吊兰品种很多,我们对于不同品种的吊兰的研究还很少,还有待于进一步的研究和探讨。2.植物叶片的整体培养:我们在试验中,曾经将初代培养的个别吊兰的整片作为一个整体放入生根培养基,发现25d后也能分化出根系。但是,只有两条根,根系发生率极低,每条根的长度很长、很细,经过连续两个月的观察,也没有更多的根出现。对于这个现象,我们没有足够多的数据支持,一直感到很困惑。我们计划在以后的研究中进一步探讨这个问题。参考文献:[1]曹孜义(等).实用植物组织培养技术教程[M].兰州:甘肃科学技术出版社,2002.[2]颜昌敬.植物组织培养手册[M].上海:上海科学技术出版社,1990.[3]桂耀林(等).植物组织培养[M].北京:科学出版社,1985.[4]赵蓬晖,张江涛,马红卫.植物组织培养中的几个常见问题与对策[J].河南林业科技,2001,21(2).[5]申玉华.组织培养技术在花卉栽培方面的应用概况[J].赤峰学院学报(自然科学版),2005,(4).(责任编辑:胡安波)