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超声波辅助提取大豆异黄酮Mauricioa.Rostagno米格尔帕尔马*,卡梅隆·g·巴罗佐2003年3月7日收到本论文,2003年6月24日收到修订版,发表于2003年7月2日摘要超声波辅助提取与搅拌萃取在从冷冻、干燥的大豆中提取四个异黄酮衍生物（大豆苷、大豆异黄酮、染料木苷高效酰苷）相比，使用不同的溶剂、提取温度。超声波辅助法提高了大豆异黄酮的提取效率，但过于依赖于溶剂的使用。还进行了样品的数量的比例的溶剂的体积和长度的提取时间的优化。异黄酮可以定量从大豆中提取，最佳提取条件为50%乙醇为溶剂，提取温度60℃，超声时间20分钟。2003ElsevierB.V.保留所有权利。关键词:超声波辅助提取；提取方式；大豆；异黄酮。1．绪论异黄酮是在黄酮类化合物中发现的几种植物衍生物。在大豆中它们以12个主要形式存在:染料木苷、大豆异黄酮、大豆苷和各自的乙酰基，丙二酸和苷元形式[1]。令人感兴趣的是，这些化合物由于其生物学效应，包括雌激素和杀真菌毒性的活动。大豆异黄酮已证实可以降低患上乳腺癌，前列腺癌和结肠癌几率，正在研究其防治更年期症状和预防骨质疏松症（见参考文献[2]的一个评论）。它们也可能是重要的抗氧化剂，因为他们有羟基基团在环羟基和/或B位置，因此能够给自由基的氢。异黄酮的抗氧化活性可能是羟基的数目和位置有关[3，4]。通常,异黄酮提取使用含水甲醇（MeOH)[5],乙醇(EtOH)或乙腈(MeCN)[7,8]。墨菲[9]等，乙腈和丙酮(Ace)CN,与浓盐酸,室温下通过搅拌萃取2小时。格里菲斯和克里森[10]比较了80%MeOH和60%MeCN从大豆蛋白酸中提取异黄酮,大豆食品和营养补充剂。他们观察到,相比80%MeOH，60%MeCN为更高效的萃取溶剂80%MeOH。最近,墨菲等人。[11]评价MeCN,丙酮,MeOH,等,加入53%的水,都可以用来提取12个主要从大豆异黄酮提取物,使用搅拌萃取技术。根据这些作者,四种不同的溶剂在不同提取异黄酮形式呈现不同的功能。通过测试MeCN(47%),一般来说,是最好的萃取溶剂对大豆食品来说。大豆面粉,MeOH(47%)比Me取得了更高的苷元水平MeCN(47%),和Ace(47%),几乎和MeOH一样CN(47%),但略微降低了总异黄酮浓度。MeOH(47%),在大豆面粉,产生类似的结果对MeOH来说MeCN(47%)、Ace(47%)和MeOH在提取糖甙(47%),但较低的回收率得到丙二酸单酰苷。寻求更环保的方法和提高生产力,新提取技术已经被开发出来,包括超临界流体萃取[12、13]和超声波辅助提取(UAE)[13、14]。其中,超声波辅助提取法是最便宜的技术和对仪器要求最低。超声波作用下有机物的提取效率的提高是由于超声波在溶剂中产生的空化现象。超声波的应用使空化泡的产生和压缩。压缩引起的压力和温度的增加导致了气泡的崩溃。随着泡沫的破灭，导致“冲击波”通过提高混合溶剂。超声也产生机械作用,允许更多的溶剂渗透进入样本的基质中,增加固相和液相之间的接触面积。再加上空化泡崩溃时产生的强化传质和重大能量破坏了细胞,增加了细胞内的产品进入批量介质。使用高温在超声波辅助提取法可以增加效率的提取过程由于空化气泡形成的数量增加。尽管新技术已经尝试了提取异黄酮,但是这些研究是在非常有限的范围和超声波辅助提取法的完整评估仍然需要建立一个通用的协议。本实验的目的是确定快速和可靠的超声波辅助提取工艺最佳提取条件。2．实验部分2．1实验材料大豆经咖啡研磨机粉碎、220℃烘干后冷藏待用。2．2化学药品和溶剂TheMeCN(Scharlau,Barcelona,Spain),EtOH(Panreac,Barcelona,Spain)和MeOH(Merck,Darmstadt,Germany)使用高效液相色谱法。水是由Milli-Q型净水器系统从Milipore(Bedford,MA,USA)取得。异黄酮标准溶液和2,5-二羟基苯甲醛取自Sigma(圣路易斯,密苏里州,美国)。2．3提取大豆异黄酮进行高强度超声波功率200W和24k赫兹(200s模型,Hielscher博士,德国)microtip配备2毫米探头。其超声振动振幅控制器将标称功率的100%。超声波浴360W(J.P.Selecta,巴塞罗那,西班牙)也被测试作为一种替代的超声波探头。拔掉进行恒定温度的温度控制器耦合超声波浴。传统提取方法搅拌萃取被用作参考与超声波辅助提取法的方法。所有的实验重复进行。三种不同的溶剂系统,MeOHMeCN,与几个水百分比(30-70%)和两个温度(10-60℃)对大豆异黄酮的提取进行了评估。最初使用提取方法0.5g的冷冻干燥的大豆萃取溶剂25毫升提取10分钟。这个方法进一步优化了提取工艺。提取后,1毫升的2,5-搅拌萃取二羟基苯甲醛作为内部标准。然后将萃取液离心10min，过滤，通过0.45毫米的尼龙注射器过滤器（微孔滤膜HN、爱尔兰）进行液相色谱分析。2．4高效液相色谱法(HPLC)高效液相色谱–紫外分析的提取物在一个水系统由自动进样器进行（717+），泵控制器（600）、泵（616），和一个光电二极管阵列检测器（996），使用一个RP-18柱（李chrospher100、5毫米，默克）和梯度的酸化水（0.1%乙酸）（溶剂）和乙腈（0.1%乙酸）（溶剂B）在流速为0.3毫升/分钟的梯度为0min，10min，15%B；30%B；20min，25min，30%B；100%B；35分钟100%的紫外从200到400nm吸光度监测。紫外光谱记录，并在254纳米的异黄酮峰面积进行定量。进样体积为10mL的校准曲线（相关系数）对大豆黄酮、染料木苷、染料木素分别是y=44751x+8805(r2=0.9980),y=77969x—31141(r2=0.9967)和y=79785x—55987(r2=0.9952)。检出限(μg/g)染料木苷、染料木素和大豆苷元,分别为1.3、1.6和2.1。检测极限计算使用该软件[18]。每个异黄酮的定量是通过使用相应的响应因子b-glucoside集团和纠正的分子质量的差异。据报道,这个方法检测值最接近正确值。高效液相色谱–质谱(MS)的提取物的分析中进行FinniganLCQ质耦合系统的Finnigan垫(美国加利福尼亚州圣何塞热电子,)。该设备配备一个光谱系统2000模型梯度泵(美国热分离产品,弗里蒙特,CA)和质量检测器(模型LCQ),由一个电喷射接口和一个离子阱质量分析器。软件的控制设备,数据的采集和处理是Xcalibur,1.2版。在LCUV应用相同的梯度。进样体积是100毫升。界面条件是:积极的电离模式中,毛细管温度:220℃,喷涂电压:4.6kV,毛细管电压:5V,专注气体流量:80(任意单元)和辅助气体流量:10(任意单元)。ESI质谱在200–600m/z范围内获得。分析了异黄酮糖甙黄豆苷,黄豆黄苷、精制和丙二酰萃取精制。每个异黄酮的识别是由比较保留时间与纯粹的标准,以及光电二极管阵列检测和MS谱(图1)。异黄酮提取物的色谱分析HPLC-UV图2所示。3结果与讨论大豆样本提取使用最初的协议(0.5g,25毫升,10分钟)和不同的溶剂系统在60℃(等哦,MeOHMe和CN,30-70%)使用搅拌萃取和超声波辅助提取法的方法。图3显示了个人的收益率(μg/g)异黄酮和图4总异黄酮的收益率(μg/g)获得了钻井废弃泥浆在不同的提取方法和提取溶剂在60℃10分钟。图1图2大豆异黄酮的提取效率是提高了超声波,但依赖于所使用的溶剂。几乎所有的病例显示,总用超声波辅助提取法和个人异黄酮是(0-15%)高于同搅拌萃取。拔掉使用搅拌萃取超声波辅助提取法也显示类似的行为:当使用纯搅拌萃取效率低了,获得了用溶剂提取的最大40-60%的水。ETOH(50%),MeOH(50%)和MeCN(40%)产生的最高收益率的溶剂总异黄酮,他们之间只有微小的差异。黄豆苷的最佳提取溶剂为50%等哦,50%Me与他们之间没有区别。黄豆黄苷,最佳提取溶剂为50%ETOH。萃取精制,观察50%等之间没有区别哦,MeOH和40%CN60%,丙二酰基衍生物萃取精制的类似结果。这些数据获得的类似墨菲etal。[11]使用搅拌萃取技术2h;他们国家,47%等哦是Me效率47%和47%MeCN异黄酮糖甙的提取。显然需要添加一定量的水(40-60%)萃取溶剂以提高大豆异黄酮的提取。这可能是由于这些化合物的相对极性,并增加传播的超声波在水溶剂。提取效率的降低共有三个用大量的水溶剂(.60%),可以合理地依靠增加生产超声波的激进分子离解的水。这些高能量的存在物种的氧化反应可以同居萃取反应时水是高于50%,目标化合物的减少食物中可用矩阵提取,因此减少了提取效率。大豆还值得注意的是,在这个示例中,丙二酰基萃取精制和精制中发现的数量要明显高于其他异黄酮,黄豆黄苷是异黄酮葡萄糖苷最低的水平。因为没有显著差异观察到50%等哦,MeOH和40%50%CN在60℃,MeCN废弃溶剂的选择,因为它可能更对环境有害,而且更有毒和昂贵的比哦和MeOH。为了评估的影响温度对异黄酮糖甙的提取效率,几个拔牙进行10℃使用超声波辅助提取法和搅拌萃取方法。无花果。表3和表4显示个人的收益率(μg/g)和总异黄酮,泥浆在不同的提取方法和提取溶剂,在10℃,10分钟。表1表2表3表4可以看出,温度对异黄酮的提取有很大的影响。增加10到60℃的温度显著增加使用超声波辅助提取法和搅拌萃取提取效率。拔牙在60℃提高萃取效率的异黄酮提取相比,在10℃。拔牙在60℃的更高的收益率可能部分归因于空化气泡形成的数量的增加和强化传质率。温度似乎影响等噢和Me一样,因为类似行为的溶剂在观察10到60℃。就是最好的复苏得到使用相同的提取溶剂10和60℃。水的必要性(40-60%)萃取剂萃取时更明显是在低温下进行。非常低的复苏的异黄酮测试得到10℃使用纯溶剂,特别是在等哦。超声波辅助提取法和搅拌萃取方法,在10到60℃,50%等哦似乎上提取溶剂提取总量和个人从地面冷冻干燥大豆异黄酮。虽然差异和个人总异黄酮的复苏(黄豆黄苷除外)不重要,Et哦提供了几个优势相比其他溶剂,低成本,较低的毒性和环境兼容性。在此基础上,50%等哦,60℃选择深造。因为超声波辅助提取法经济复苏产生高于搅拌萃取萃取的萃取条件,下面的优化过程进行了超声波辅助提取法。提取时间和样本的数量必须进行调整,以获得定量的复苏。建立动力学的提取、使用的样本数量是减少了从0.5到0.25,0.1和0.05g(表1)和提取的时间延长到15,20到30分钟(表2)。减少样本量和维护提取溶剂体积(25毫升)增加了样本:溶剂比例有利于提取效率。这也会减少可用的异黄酮提取允许一个确定当量化实现复苏。减少样本的数量和维护提取周期(10分钟)不完善黄豆苷提取率,黄豆黄苷和丙二酰萃取精制(表1),只有萃取精制提取显示一个小的数量增加(1.7--12.5%)与样本容量的减少。所以,它可以得出的结论是,任何样本质量对提取溶剂体积比之间的0.5g/25毫升0.05g/25毫升可以使用,并会给类似的萃取效率。如上所述,仅观察到萃取精制提取效率增加,表明仍有萃取精制样品。因此提取时间延长。提取时间越长,异黄酮的提取效率越高,20分钟(表2),20至30分钟,测试所有异黄酮的提取量略有下降。可能是氧化可能发生20分钟后提交声波降解法。从这些数据Me们可以推断,通过抽取10分钟,可以提取的一大部分大豆异黄酮(80-90%)存在于面粉样品。如果客观定量拔牙,拔牙的应该使用20分钟。为了验证样本中异黄酮的含量,并确保定量提取得到使用抽取20分钟,拔牙(4325毫升)相同的样品(0.5g),使用50%等哦,60℃10分钟,进行(表3)。异黄酮的总量中获得的样本的抽取,20分钟(1353.47μg/g)相媲美,获得抽取,使用50%等哦(1356.77μg/g)。因此,大豆的异黄酮含量(μg/g)示例:黄豆苷:216.7767.67,黄豆黄苷:84.24