茶多糖的提取分离.

•茶多糖提取分离的研究意义及现状•茶多糖的提取工艺流程和方法•茶多糖的分离及纯化•茶多糖提取分离所用仪器设备多糖广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中,是构成生命的四大基本物质之一。糖类尤其多糖是近年来研究比较热的一类重要的生物高分子化合物和重要的信息分子，它分布广泛!功能多种多样，茶多糖也不例外，其主要功能据报道有降血糖、降血脂、降血压、抗血栓等作用，具有相当广阔的应用前景，茶多糖的研究首要是提取分离纯化。多糖因其具有多种生物活性而越来越受到人们的关注,特别是近十余年来,随着世界各国科学家对植物多糖分离纯化、结构分析、理化特性、免疫学及药理学等方面研究的不断深入，寻找一种资源相对丰富,成本低廉的植物多糖源已成为食品界、医药界关注的焦点。中国对多糖的研究始于20世纪70年代，且发展很快。由于多糖多种多样的生物活性功能以及在功能食品和临床上广泛使用，使多糖生物资源的开发利用和研究日益活跃，成为天然药物、生物化学、生命科学的研究热点。茶多糖是茶叶复合多糖的简称，由糖类、果胶、蛋白质等组成，其中多糖部分包括阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、半乳葡聚等水溶性多糖。具有降血糖、降血脂、增强免疫力、降血压、减慢心率、增加冠脉流量、抗凝血、抗血栓和耐缺氧等作用，近年来发现茶多糖还具有治疗糖尿病的功效。清水岑夫（1987）研究发现，服用茶多糖链脲佐菌素诱发的高血糖小鼠血糖明显下降，最高下降率达40%；对正常小鼠腹腔注射茶多糖500mg/kg，给药7h后出现降血糖效果。王小刚等（1991）报道，分别给正常小鼠灌胃50mg/kg和100mg/kg的茶多糖，小鼠血糖浓度分别下降了14%和17%；而分别给正常小鼠腹腔注射25mg/kg和100mg/kg的茶多糖，其血糖浓度分别下降48%和52%，因此，不同给药方式降血糖的效果不同。Isigukik.等（1992）发现腹腔注射茶多糖可使大鼠的血糖下降；将茶多糖用于糖尿病的辅助治疗，所有患者的症状均有好转。TadadazuT.等（1998）对链脲佐菌素诱导发的高血糖模型大鼠用茶多糖灌胃，发现有明显的降血糖用用。据江和源等（2004）报道，茶多糖对正常小鼠及四氧嘧啶必糖尿病小鼠具有降血糖作用，这可能与茶多糖能减弱四氧嘧啶对胰岛β细胞的损伤或改善受损伤的β细胞的功能有关。已往的研究证明,茶叶原料的老嫩程度对茶多糖含量的影响很大,并表现出随茶叶粗老程度的递增,茶多糖含量增加。日本东京医科大学的研究认为,茶多糖体复合物在85℃以上时,其有效成分的生物活性就会受到破坏,因此建议茶多糖的提取在常温或低温下进行。分离提取和精制纯化方法对茶多糖的生理活性有很大影响,茶多糖的提取制备通常可采用溶剂提取、凝胶层析、膜分离等手段。◆单一提取工艺流程1.超滤原料→温水浸提(2～3次)→水提液超滤→乙醇沉淀→冷冻干燥→TPS提取物2.醇沉淀原料粉碎一温水浸提一水提液一浓缩得浓缩液一乙醇沉淀一沉淀物一冷冻干燥TPS提取物◆综合提取工艺流程1.原料→沸水浸提(2次)→离心、除渣→提取液氯仿萃取→有机层→回收氯仿、精制、干燥→咖啡碱有机层→回收、干燥、精制→茶多酚水层→乙酸乙酯萃取水层→乙醇醇析→离心、取滤渣、精制、干燥→茶多糖2.原料→乙醇浸提→滤渣酸性乙醇提取→滤液丙酮分离→回收、精制干燥→茶多糖有机层→回收、精制、干燥→咖啡碱滤液浓缩氯仿萃取有机层→回收、精制、干燥→茶多酚水层一乙酸乙酯萃取水层→浓缩、干燥→水溶性复合物3.CTBA沉淀原料粉碎→温水浸提→水提液→浓缩得浓缩液→5％CTAB沉淀→20％NaC1溶解→水溶液→乙醇沉淀→沉淀物→冷冻干燥→TPS提取物4.乙醇提取原料→乙醇浸泡回流(3次)→取滤渣→沸水提取(3次)→过滤→提取液浓缩、脱脂、脱蛋白、脱色等→乙醇沉淀(2次)→取滤渣精制、干燥→TPS提取物CTAB沉淀法制备的茶多糖粗提物中，蛋白质含量达2.81％，CTAB沉淀多糖的同时，把蛋白质也一起沉淀下来；醇沉淀法提取的茶多糖的多酚含量最高；与CTAB沉淀法和醇沉淀法相比，超滤法所得的粗茶多糖的多糖含量高，多酚、可溶性蛋白质含量均较低。通过纸层折和气相色谱分析，3种工艺所提取的茶多糖均由阿拉伯糖、木糖、核糖、葡萄糖、半乳糖及半乳糖醛酸组成，组成比差异不大。◆酶法提取植物的细胞壁主要由纤维素、半纤维素、果胶质、木质素等物质构成致密结构。添加适量的纤维素酶、果胶酶和蛋白酶有利于细胞壁和细胞间质层的分解，提高细胞内物质的溶出率，从而提高多糖的提取率。有学者发现，在茶汤中添加0.3％的纤维素酶可使多糖浸出率提高20％左右。用低温水法提取茶多糖和纤维素酶法提取茶多糖，发现纤维素酶法提取的多糖含量比水法提取的高63.3％，多糖总提取率达2.97％，粗多糖(干重)总提取率达7.93％。也有学者比较了热水提取、复合酶提取、果胶酶提取对一次热水提取后的茶渣进行提取，结果表明，采用第一次水提结合第二次复合酶提的提取率，是热水二次提取的1.55倍。◆水提法茶多糖易溶于水，可用沸水将茶多糖从茶叶中提取出来。研究表明，总糖含量：酸性乙醇提取法(47.7％)水提法(43％)热酚(8％)，前两者相差4.6％，从生产成本的角度和安全性考虑，宜采用水提法。◆超声波法提取超声波提取多糖是利用超声波的空化作用加速植物多糖成分的浸出提取，另外超声波产生的机械振动、乳化、击碎、化学效应等也能加速多糖成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取。傅博强等研究了纤维素酶法提取茶多糖最佳工艺的基础上，还研究了超声振荡对多糖提取率的影响，结果表明，用超声波辅助酶法时，酶解一超声法比超声波一酶法高10.4％，比单独酶法高4.1％。◆微波辅助法提取微波技术应用于TPS提取，不仅能提高TPS得率，而且降低成本的同时也减少污染。聂少平等将微波提取与超声提取与水提取比较后发现，微波提取方法时间短，得率高，是茶多糖提取的一种优选方法。同时，微波提取对茶多糖抑制淀粉酶酶活的活性无影响。◆脱蛋白粗多糖中含有大量蛋白等杂质，不仅会使荼饮料因美拉德反应而使饮料色变，而目往往有沉淀物产生，故需除去蛋白质。常用的脱蛋白方法有以下几种：(1)Sevag法：该方法是经典的脱蛋白方法，其优点是操作条件温和，可避免多糖降解，缺点是一次只能脱去少量蛋白，即使重复多次，也难将蛋白除尽。倪得江研究比较发现，前3次共脱去绿茶多糖中总蛋白的40％，而只脱去乌龙茶多糖中总蛋白的21％。(2)三氯乙酸法：汪东风等认为，茶多糖是一类与蛋白相结合的糖复合物，不能用蛋白酶去除茶多糖中的杂蛋白，然而Sevag法又难将茶多糖中的游离杂蛋白除尽，因此在样品纯度要求高、原料来源广泛的情况下，可适当采用脱蛋白效果更好的三氯乙酸法。(3)三氟三氯乙烷法：该方法提取效率高，但三氟三氯乙烷易挥发，不宜大量应用。◆脱色茶多糖的色泽也是障碍茶多糖分离纯化、化学结构、作用机理及构效关系的研究的一个瓶颈。因此，对粗茶多糖进行脱色，一方面可以改善多糖的外观，提高产品的纯度，另一方面也可为多糖的结构及其构效关系等理论研究打下基础。(1)离子交换法：兼有脱色分离的作用，常用的离子交换树脂有DEAE纤维素和Sepharose系列。(2)金属络合法：采用一重金属铁和铜、铅等沉淀茶多糖，从而使茶多糖和部分色素相分离。(3)物理吸附法：物理吸附法常用聚酰胺大孔吸附树脂、潘1生炭、硅藻土、高岭土和PVPP等作为吸附剂。(4)氧化法：采用H202，虽有一定的脱色作用，但对茶多糖有降解。在以上方法中，以离子交换树脂法和聚酰胺大孔吸附树脂应用较多。◆沉淀法分级分离进一步分离茶叶复合多糖纯化方法主要有如下几种：(1)分步沉淀法：不同性质以及不同分子量段的多糖在不同浓度的乙醇中的溶解度是有差别的，利用这一差别，可以分离沉淀到某一性质或某一分子量段占主要部分的茶多糖。黄桂宽等用40％和60％的乙醇分级沉淀茶多糖，干燥分别得到浅黄色和灰白色两种多糖TPS-1和TPS-2，总糖含量分别为48.24％和57.71％，其中TPS-1为中性杂多糖。同时，采用不同的溶剂可以提取出茶叶中的水溶性多糖和碱溶性多糖。(2)季胺盐沉淀法：季胺盐沉淀法常采用长链季胺盐，如十六烷基三甲基溴化铵(CrAB)、十六烷基吡啶(CPC)，能与酸产生多糖结合后沉淀，利用季胺盐这一特性可以分离茶叶中的酸性多糖和中性多糖。杨其林等用正交试验确定CTAB沉淀茶多糖的最佳工艺条件为：离心时间12min，CTAB浓度0.05g／ml，加入量25ml，沉淀时间6h。在此条件下，茶多糖得率为1.34％。◆超滤法采用超滤膜技术对多糖进行脱盐、分级和浓缩，收率高、极少破坏多糖的生物活性，又没有传统有机溶剂法的试剂残留问题，目前成为活性多糖研究的重要手段。依据不同超滤膜允许不同分子量和形状的物质通过，多糖溶液通过各种已知的超滤膜就能达到分离。从现有的报道来看，茶叶中具有生理活性的多糖相对分子质量约在4万～10万之间，因此一般选择截留分子量为4万以上10万以下的超滤膜。KerlichiI曾用超滤法制备出纯化的茶多糖。尹军峰等通过对不同孔径膜的筛选试验，确定50K的膜为富集茶多糖最好的膜。◆柱层析柱层析分离方法是纯化多糖最常用的方法。该法比较温和，不但能有效精细分离茶叶中的多糖组分，而且能较好保持多糖的结构和生物活性。主要采用离子交换剂、凝胶、大孔吸附树脂等填料装层析柱。(1)纤维素阴离子交换剂柱层析：DEAE-纤维素适合分离各种酸性、中性多糖以及粘多糖。茶叶多糖为酸性多糖，粗多糖颜色较深，可选用便宜的DEAE纤维素脱色分离。用pH相同但离子强度不同的缓冲液即可将酸性强弱不同的酸生多糖分别洗脱下来。但如果柱材料为碱性，则中性多糖也能吸附。许新德等通过DEAE-纤维素柱从粗老绿茶中分离纯化到1种中性多糖和3种酸性多糖TPSI、TPSII、TPSm。(2)凝胶柱层析：对于脱色后的茶多糖，可用分离效果更好的Sephadex型或Supercyl型离子交换剂分离。凝胶柱层析是根据多糖分子的大小和形状不同进行分离。一般先用SephadexG50分离相对分子质量为1万以下的各组分，然后用SephadexG150-200以达到进一步纯化的目的。王丁刚等将20mg茶叶多糖粗品用少量0.1mol／LNaCl溶液溶解，SephadexG-100柱层析(20×430mm)，用0.1mol／LNaC1溶液洗脱，苯酚-硫酸法进行检测，收集糖反应阳性高峰部分，每管收集3ml，醇沉，干燥，即得纯化的茶叶多糖。（主要从降低成本、提高经济效益方面阐述）◆单独提取法与综合提取法的比较对由以上提取方法所得到的产物进行比较可知，单独提取法仅提取茶多糖，其中的茶多酚和咖啡碱则未被利用；综合提取法分别提取茶叶中的茶多糖、茶多酚、咖啡碱，可以得到3种产品，具有简化、省试剂、效益高等优点。在工业生产中，宜采用综合提取法，有利于降低成本、提高经济效益。仪器介绍•1．加工设备：中药醇提装置、离心过滤装置、高效离心薄膜浓缩装置、有机溶剂回收装置、萃取分离装置、真空干燥设备、冷却系统、贮液槽、喷雾干燥设备、透析装置、粉碎机及供水系统等。（年产茶多酚30吨，咖啡碱3吨，茶多糖1.5吨计，设备投资180~210万元）•2．厂房及附属设施：厂房面积：800~1000㎡，100吨贮水池、供应车间冷凝用水和洗涤用水，并建有循环用水池。锅炉：1T/h，供生产用汽。80KW的变电装置。•3．人员：生产及技术人员（含化验员两名）38人流程图茶多酚，茶多糖的超滤膜提纯和反渗透浓缩仪器设备