茶树在冷驯化过程中的全基因表达谱

茶树在冷驯化过程中的全基因表达谱摘要：茶树需要进行冷驯化过程来增强其在冬季的抗寒性。我们对于茶树在低温下分子水平方面的改变知之甚少。为了阐明冷驯化的分子机制，我们采用RNA测序和数字基因表达技术（DGE）来研究在茶树冷驯化过程中的全基因组表达谱。使用Illumina公司测序平台，我们获得了约5735万的RNA序列读取。这些读取组合成216831转录谱，平均长度为365bp，N50的平均长度为529bp。总的来说，1770个差异表达的转录被确定，其中1168个上调表达和602个下调表达。这些包括一组冷传感器或信号转导基因，冷反应转录因子基因，等离子体膜稳定相关基因，化学反应应答基因和解毒酶基因。DGE和定量RT-PCR分析进一步证实RNA序列分析结果，通路分析表明在茶树冷胁迫的反应中“碳水化合物的代谢途径”和“钙信号通路”可能发挥重要作用。针对茶树对于低温，非结冰温度的反应我们的研究提出了转录谱的全面调查和茶树在寒冷驯化过程分子机制在产量的见解的全面调查。它也可以作为耐冷性相关研究的宝贵资源，有助于提高对于冷相关基因耐低温和植物与环境的相互作用的理解。关键词：茶树；冷驯化；RNA序列；全基因组表达谱1.绪论低温是温带植物在其生命周期必须应对的最重要的环境因素之一。有些植物在暴露于低温但不结冰的温度下生存一段时间之后可以提高他们的抗冻性，这个过程被称为冷驯化（CA）[1]。CA是一个复杂的过程，涉及到细胞、生理、代谢和分子修饰。当植物感知寒冷温度的时候，一系列的保护机制被引发[2-4]。这些包括重置蜂窝框架、等离子体的结构和功能的交替组成、合成抗冻剂的分子如可溶性糖，糖醇和低分子量的含氮化合物、降低自由水含量的比值、提高活性氧（ROS）的清除作用、并引入抗冻蛋白。这些变化帮助植物在低温下维持物质和能量的代谢平衡。对于上述的变化报道了一组冷相关基因[2-7]。此外，在大范围植物物种冷驯化中基因表达的改变已经被证明了，数百的冷诱导基因也已经确定了[8]。茶是世界上最流行的非酒精性饮料，而且茶树是中国，印度，斯里兰卡，肯尼亚等其他国家最重要的经济作物之一[9]。作为一种常绿木本植物，茶树可以在热带和亚热带气候生长。由于气候变化，茶树必须应对冬季的低温。低温是一个最关键的环境因素，可以限制其增长，生存和地理分布[10]。因此，寻求提高植物对低温抗性的方法是很重要的。像其他多年生常绿木本作物，在冷驯化过程中，茶树的抗寒性随着温度的降低而增强，随着温度的增加而减小。先前的研究表明，当平均气温下降到7°C左右，茶树经过CA进程，并在平均气温增加超过9°C，茶树启动驯化过程[11]。在茶树冷驯化过程中很少有集中于细胞，生理和代谢变化的研究。当茶树经过CA过程，增加栅栏组织厚度和增强细胞膜的稳定性。此外，胞浆和束缚水比的浓度，细胞膜上的不饱和脂肪酸和总蛋白量，叶片可溶性蛋白的含量都增加了。同时，一些解毒酶的活性增加了，如过氧化氢酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD），过氧化物酶（POD）和酯酶（EST），而代谢活性降低[11]。茶树中一些冷诱导基因已被克隆[13,14]。作为一个复杂的生物现象，茶树抵抗低温的能力被一系列复杂调控网络基因调控[15]。使用“组学”的研究策略去理解茶树CA机构是提高茶叶产量和地理分布的关键。RNA序列是最近开发的方法，它是使用大规模并行测序策略生成的转录谱。它已成为高通量序列测定的一种有效方法，能够空前地提高效率和基因发现的速度[16,17]。数字基因表达（DGE）是一种基于标签根据短标签所产生的核酸内切酶的测序方法。基因在样本中的表达水平是通过计算每个转录组生成的标签数量而衡量的[18]。这项研究表明，使用RNA序列和DGE相结合的方式研究茶树的转录谱的首次尝试，从而获得一个更深入的CA的分子机制。从茶树中产生的转录谱不仅有助于深入了解参与冷驯化过程的基因，也提高了我们对植物与环境的相互作用的理解。2.材料与方法2.1耐低温试验和RNA的制备茶树品种（L.）O.KuntzeCV，龙井43种在中国国家种质库（CNGHTR）杭州茶茶叶研究所，中国农业科学院。2010年10月开始，到2011年3月被选定在每10–15天（当平均温度高于15°C）摘取完整的成熟的叶子。所有的样品用去离子水冲洗并且分为两个部分，一部分采用液氮在−80°C存储快速冻结，另一部分使用电解液泄漏试验评价耐低温。纯植物提取试剂盒被用来进行总RNA提取，Agilent2100生物分析仪被用来RNA完整性测试其完整价值至少为8。低温耐受性从叶子的样品中测定了，叶子样品电解液泄漏检测与以前的研究类似。简而言之，叶子用去离子水冲洗。叶样品（直径5mm）用打孔机和叶的中脉中排除。叶子样品（0.5g）被放置在封闭含有去离子水20毫升的小瓶，分别在25°C在旋转摇床摇24h。然后测定溶液的电导率（L1）。EL（相对电导率）的定义如下：EL（%）=（L1/L2×100%）。2.2文库的制备与RNA序列对RNA序列的样品的制备使用Illumina公司的试剂盒并且遵循制造商的建议。总之，mRNA从总RNA纯化20μg，用Oligo（dT）磁珠，其次是碎片，其mRNA被高温下使用的二价阳离子分割成小碎片。裂解的RNA片段被用来进行合成cDNA第一链，使用逆转录酶和随机引物后通过使用DNA聚合酶I和RNaseH合成第二链cDNA。最后的修复过程和连接电源适配器，产物通过PCR被富集了，从而形成最终的cDNA文库。cDNA文库从5′和3′端使用IlluminaHiSeq™2000平台根据制造商的指示剂进行测序。荧光图像处理，是由Illumina数据管道1.4行处理基地呼叫和质量值的计算，读取其中290bp的配对末端。2.3短RNA序列数据读取在我们的研究中，我们从茶树的三个样品中采用RNA序列，在CA的过程中代表三个关键阶段的，三个的样品包括CA1，CA3和CK。我们称这些数据集1。我们的RNA序列数据集的访问代码是SRA061043。以前的研究报告了茶树的转录组，读取来自Illumina格尔平台产生的75bp的配对末端，我们称这个数据集2。它是srx020193的加入代码，包括七种不同的组织采取样品：茶树的嫩枝，嫩叶，成熟叶，茎，年轻的根，花蕾和未成熟种子[21]。2.4预处理和从头组装原始数据从头组装之前进行预处理：劣质的核苷酸（我们定义的核苷酸与质量分数小于20的低质量的核苷酸）在过去的20个周期，模糊不清的核苷酸在前五次循环中被自定义的Perl脚本修剪。经过预处理后，共获得4.96G碱基（GB），1.90GB和6.86GB质量过滤短读取分别为数据集1，数据集2和数据集3。从头组装的这三个数据集分别被“三位一体”分开[20]。2.5去除冗余一些亚型通过三位一体的重建了，使用具有相同的只有小的变化的“蛹组件”和“蝶子组件”，如单核苷酸多态性，小的插入或缺失等变异；装配结果冗余。CD-HIT-EST记录超过99%的同源性完全覆盖的时候用来去除较短的冗余转录。这套转录本用于进行计数统计的基本组件和下游分析。2.6基因注释和分类所有的非冗余的转录（≥100bp）用于搜索和NR，uniref90[22]，TAIR10，KEGG（58版）[23]和KOG[24]的数据库,通过BLASTALL包（释放2.2.22）与电子≤10显著阈值5。每一个已知基因同源的击中是最好的解析和分配。基因本体论（GO）是基于使用Blast2go软件nr数据库达到最佳比对分配（版本2.3.5）[25]与10-5值阈值记录每个转录本。基于下列顺序Blastx分析结果确定了组装转录的ORF：NR，uniref90，KEGG和KOG。从对齐的区域的两侧延伸，使用自定义的Perl脚本的标准密码表，编码区序列翻译成氨基酸序列。对于那些没有任何已知的基因转录撞到数据库，利用软件bestorf训练有素的拟南芥EST参数的预测是最好的潜在的编码区。预测的氨基酸序列已提交搜索对Pfam数据库域或家庭使用HMMER3注释，用最好的比赛级协议。“优化允许重叠匹配”的方法是用来解决复杂的重叠的蛋白结构域。2.7数字基因表达三样品的标签库的制备使用Illumina基因表达的样品制备试剂盒平行执行。简单，从每个样本总RNA6μG用于磁寡捕捉mRNA（DT）珠。第一和第二链cDNA的合成。珠结合cDNA随后被消化与NlaIII。cDNA片段3’端分别与磁珠纯化，和Illumina适配器1连接到5’末端。2.8实时定量PCR（qRT-PCR）分析为了验证RNA序列和DGE实验的可靠性，28个转录本用于进行定量PCR（qRT-PCR）检测。RNA（1μG）的每个样品用DNaseI处理，然后用实时定量PCR试剂盒进行以下参数：95°C时30S，94°C15S，40次，60°C为34秒。使用AppliedBiosystems7300序列检测系统测定荧光强度。每个反应进行一式三份，为了保证用于qRT-PCR实验的参考基因的稳定性，我们在冷驯化过程分析了4个常用的管家基因的基因表达的稳定性。正如之前有人报道，我们的研究结果还表明，18SRNA基因是最稳定的表达水平不变，最后被选为本研究的参考基因。在三个样本的基因相对表达的计算采用2−ΔΔCT前面描述的方法。CK样本的实时荧光定量PCR的结果将基因表达的相对变化，因此，CK样本对CK的相对值为1，相对值的CA1和CA3区样本进行归一化处理。所有的数据都显示为平均±SD和所有的引物信息。3.结果与讨论3.1CA过程中茶叶植物耐冷性的变化茶树抗寒性的变化在不同温度下，可以使用电解液泄漏检测的相对电导率监测。例如一个完整的CA的自然过程，温度变化周期从2010十二月至2011三月。在十二月一日之前，室外平均温度（五天）在10°C以上，茶树叶片的相对电导率（CK）在~100%，表明茶树具有低水平的耐冷性。茶树经过一段时间后，在相对低的温度下（＜10°C），其相对电导率下降，茶树的抗寒性增强。当温度下降到最低点，相对电导率也达到最低水平，耐冷性是在最高水平（CA1）。后来，温度上升，当平均温度达到10°C以上，相对电导率增加到80%，然后保持在较高的水平。茶树是后来去驯化（CA3），其耐冷性弱。在CA的过程中获得的冷环境的转录反应，我们从三个阶段选择了茶树叶片，非驯化（CK），完全驯化（CA1）和去驯化（CA3），用于RNA序列和数字基因表达（DGE）的研究。3.1.1RNA序列和从头组装我们使用Illuminahiseq2000基因组分析仪进行RNA序列分析海马CA1，CA3和CK。完全，57350000配对末端长为90bp。由于低质量的核苷酸从两端读可能导致不正确的组件输出[19]，我们削减了劣质的或模糊的核苷酸在两端的读取。使用三位一体从头组装和修剪进行读取[20]。“三位一体”是专门为从头组装的短RNA序列读取数据，这已被证明是最好的单剂汇编[19,20]。总的来说，226026的转录被重建了。在先前的研究描述中去除小的变化引起的冗余的转录后[19]，获得了最后一组216831个转录本。平均记录大小为356bp，与N50的平均记录为529bp。Shi等人先前的研究报告了茶树的转录组[21]。他们生产的RNA序列数据是使用Illumina的GAIIX（以下简称数据集2）从混合组织茶树得到的。组合数据集的1和2也被生成了，我们称之为数据集的3，茶树占所有可用的RNA序列数据。短的读取数据集2和集3按上述程序进行处理，然后分别用于从头组装。数据集的1汇编结果达到最长的平均读长和N50，而从数据集的3的收益率的成绩单和总的碱基对数量是最多的。为了在从头组装中分别评价短读的使用效率，我们将RNA序列读取回到三套重建的成绩单，从数据集的1达到最佳性能生成转录，并为我们的短最高映射比读。超过10%的短读取失败，只有数据集2进行从头组装，表明冬虫夏草以前的转录组序列是远远没有饱和。虽然越来越多的转录组序列，使用数据集3而不是数据集1可以产生从头组装，测绘率无法提高，表明从数据集3中的额外转录是比其他