荧光光谱.

荧光光谱荧光简介常用荧光光谱及特征荧光强度影响因素荧光光谱的光谱参数用途荧光：某些物质受到照射后发出能量较低的光，一旦光照停止，光线也立即消失，称为荧光。入射光和发射光频率之差称为斯托克频移。满足上述条件即为荧光。因此荧光范围比较宽，从X射线到红外光谱区仍然是荧光。其他的能量如（化学反应、加热、生物代谢等）也会有荧光。生活中很多现象都与荧光相关。如：钞票防伪，日光灯管，萤火虫发光。1.荧光介绍1）荧光产生及其物理机制S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫a)光吸收：荧光物质从基态跃迁到激发态，过程约10-15s。此时，荧光分子处于激发态。b)内转换：处于电子激发态的分子由于内部的作用，以无辐射跃迁过渡到低的能级。c)外转换：处于电子激发态的分子由于和溶剂以及其他分子的作用，以及能量转移，过渡到低的能级d)荧光发射：如果不以内转换的方式回到基态，处于第一电子激发态最低振动能级的分子将以辐射的方式回到基态，平均寿命约为10ns左右。e)系间转换：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。如电子自旋改变，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。f）振动驰豫：高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。2.常用荧光光谱1）荧光的激发光谱，发射谱激发谱：固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。荧光光谱有瞬态荧光光谱和稳态荧光光谱两类。通常荧光光谱指的是稳态荧光光谱。荧光的发射谱：固定激发波长，发射强度与发射波长的关系。荧光光谱特点灵敏度高：比紫外-可见分光光度法灵敏度高2-3个数量级，比原子吸收分光光度法高103～104倍，检测限可达ng／mL线性范围宽:0.005mg/L-50mg/L分析成本低设备简单，操作简单快速，计算机进行仪器控制和数据处理提供激发光谱、发射光谱等许多信息2).荧光光谱的特征a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图l2,l1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l‘2)。c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。3.荧光光谱仪及使用技术光源激发单色器样品池检测器发射单色器检测器荧光是散射谱，所以一般在垂直入射方向接收。背景是没有入射光，是“暗背景”，因此灵敏度更高。1）荧光光谱仪9光谱测试1.开机电源——灯源2.发射谱根据吸收谱中感兴趣的峰确定激发波长，选择合适的发射谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等进行发射谱的扫描。3.激发谱根据发射谱中感兴趣的峰确定发射波长，选择合适的激发谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等进行激发谱的扫描。104.发射谱根据激发谱中感兴趣的峰确定激发波长，选择合适的发射谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等进行发射谱的扫描。5.重复3、4步循环扫描得到理想的光谱图。7.关机光源——电源6.保存数据11光谱数据处理测得的数据结果需要应用origin软件进行数据处理和作图分析。为了消除仪器本身的影响，测得的光谱曲线需要应用校正曲线进行校正。校正过的光谱数据可以应用色坐标软件进行颜色分析。荧光随着浓度增高，强度反而减小，称为浓度猝灭。原因可能是：a浓度增加，分子碰撞机会增加，增加了非辐射损耗。b溶液中其他杂质吸收发出的荧光。（内滤光）c吸收谱和发射谱重叠，荧光又被吸收。（自吸收）d仪器原因3）.荧光光谱的环境效应5.荧光实验方法及其用途荧光猝灭荧光偏振荧光能量共振转移时间分辨荧光光谱荧光标记荧光猝灭泛指任何可以减低样品荧光强度的过程。狭义主要指那些由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用所引起的荧光强度降低的情况。原因：溶剂猝灭剂和荧光物质之间发生相互作用而引起荧光效率降低或激发态寿命缩短，导致强度降低。1）.荧光猝灭（1）荧光偏振现象及用途一旦用偏振光照射，从许多样品出射的光也是偏振的。当样品各个方向出射的偏振光是不相同的，可以说样品显示出偏振的特性。研究偏振可以提供分子及周围环境更多的信息：偏振光照射到荧光分子上，分子对光的吸收和发射过程与分子框架相对偏振光的偏振方向相关。荧光偏振可以用来测量蛋白质的变形，蛋白质的结合以及蛋白质的内部动力学。2）荧光偏振3）.荧光能量共振转移4).时间分辨光谱：输入脉冲，然后进行对接收的信号进行相应分析。时间分辨寿命；时间分辨各向异性。荧光各向异性可以采用稳态测量，也可以用瞬态方法进行测量。稳态测量是得到的是一个平均值，虽然容易解释，但需要做很多假设。瞬态测量是测量脉冲激发后的时间相关各向异性。可以直接从实验数据中观察得到并进行解释。各向异性与样品尺寸、形状以及标记分子的柔性相关，需要从各种分子模型进行计算拟合。各向异性衰减可以从TD或FD方法得到。目前还是采用时间分辨进行测量。荧光寿命当某种物质被一束激光激发后,该物质的分子吸收能量后从基态跃迁到某一激发态上,再以辐射跃迁的形式发出荧光回到基态.当激发停止后,分子的荧光强度降到激发时最大强度的1/e所需的时间称为荧光寿命.5).荧光标记荧光标记是将荧光基团共价连接到蛋白、核酸等分上的过程。通常使用能够选择性地与目标分子上存在的功能基团反应的荧光素基团衍生物来完成这样的过程。最常见的标记过的分子是抗体，经常使用标记过的抗体来检测特定的目标分子。