荧光定量PCR技术临床应用

荧光定量PCR技术在临床医学研究中的应用及注意事项内容提要一、基因诊断技术在医学检验中的地位二、荧光探针定量PCR在临床医学中的应用三、荧光探针定量PCR在临床医学中的主要问题基因诊断的物质基础及与其它诊断方法的区别基因诊断免疫学诊断临床诊断细胞膜细胞核DNA转录mRNA翻译蛋白质临床表现生化诊断临床实验医学发展三个时代标志技术性质生化诊断时代生化分析表象免疫学诊断时代酶免、放免表象分子(基因)诊断时代基因体外扩增(PCR)本质1、病原体的定量检测及药物疗效考评（HBV）2、肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测（P53）3、遗传病基因的检测（地中海贫血）4、与疾病相关的各种蛋白质的基因表达的定量检测6、建立病原体的分子诊断标准荧光定量PCR在临床医学中的应用荧光定量PCR在病原体检测中的应用一、肝炎病毒定量检测二、性病病原体检测三、优生优育相关项目检测四、结核杆菌及呼吸道病原体检测五、其他病原体检测病毒性肝炎概况•病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起，以肝脏炎症和坏死病变为主的一组传染病。按病毒的生物学特征、临床和流行病学特征，1989年在日本东京的国际肝炎学术讨论会上，将其分为甲（A）型、乙（B）型、（C）型、丁（D）型、戊（E）型肝炎，以后还报道了己（F）型和庚（G）型。•我国是个肝炎大国，病毒性肝炎发病数位居法定管理传染病的第一位，仅乙型肝炎病毒感染者就达1.2亿，每年新增加的感染者也在百万以上，丙肝发病率亦趋上升。慢性乙型肝炎病程迁延，如得不到及时的治疗，部分将会发展为肝硬化甚至肝癌，严重危害人类健康。HBV基因型与血清型关系及流行病学分布基因型血清学亚型基因长度(nt)临床突变率主要流行地域PC*(G1896A)BCP**(1762/1764)Badw2ayw1321550％（常）T185816％东南亚、中国、日本Cayr;adrq+;Adrq-;adr;adw2321550％（常）T1858或C185858％（常）东南亚、中国、日本、澳洲、美国病原学乙型肝炎检测标志物HBsAg，抗-HBsHBeAg，抗-Hbe抗HBcHBV-DNA乙型肝炎免疫检测和PCR结果异同•“大三阳”PCR结果阴性•抗-HBs阳性，PCR结果阳性荧光定量PCR技术对性传播疾病的检测一、淋球菌（NGH）二、沙眼衣原体、解脲脲原体（CT、UU）(有证）三、梅毒螺旋体（TP）四、单纯庖疹病毒（HSV）五、乳头瘤病毒（HPV）（有证）六、人类免疫缺陷病毒（HIV）PCR技术对性传播疾病检测的注意事项1标本的选取TPHSV2临床疗效考评超高倍荧光定量PCR诊断TORCH综合征传统的TORCH病原体：TOX,other,RV,CMV,HSV新近发现的TORCH：麻疹V、腮腺炎V、水痘—带状庖疹V、肠道V、乙肝V、丙肝V、HPV、EBV、HIV、人庖疹V6、人微小病毒B19等TORCH感染的实验室诊断一、组织培养：慢，费力，阳性率低二、血清学诊断：IgG：IgM：1、不能定量分析2、抗体的产生受多种因素的影响3、产生假阳性三、基因诊断方法原理：检测TORCH病原体的核酸优点：1、客观指标2、敏感性、特异性高3、定量指标荧光定量PCR在TORCH诊断中的应用：1、筛选TORCH的患者2、建立TORCH的分子诊断标准荧光定量PCR技术检测TOX孕妇TOX感染的危害孕早期（3月）25%感染胎儿，后期65%感染胎儿但早期感染危害严重易感人群1、吃生或未熟的含有囊虫或囊虫卵的肉类2、从事动物尸体、皮毛等工作孕妇3、饲养宠物，如猫、狗者荧光定量PCR技术检测HCMV人群自然感染率达到60—80%，可通过胎盘、产道、母乳传染初次感染HCMV的孕妇传染胎儿的危险性15——50%再次感染仅为0.5%—2.5%注意事项•缺乏分子诊断标准•辅助指标荧光定量PCR技术检测21三体综合征孕妇外周血中有胎儿的少量细胞通过PCR技术检测孕妇外周血中的胎儿细胞荧光定量PCR技术用于性别鉴定荧光定量PCR检测SRY基因SRY基因，雄性的性别决定基因，指Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段科研应用不提供商业试剂EB病毒载量与鼻咽癌血浆EBV载量与鼻咽癌显著相关鼻咽癌病人血浆EBV与肿瘤复发相关10个复发病人：32，250copies/ml15个二年持续缓解病人：0copies/ml17个随访病人：临床恶化前6月显著升高荧光定量PCR技术用于肺部感染的诊断一、肺炎支原体的检测二、结核杆菌的检测意义：1、快速诊断2、治疗方案与细菌感染的治疗方案不同地中海贫血•海洋性贫血又称地中海贫血（Thalassemia）。是一组遗传性溶血性贫血。其共同特点是由于珠蛋白基因的缺陷使血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或不能合成。导致血红蛋白的组成成分改变，本组疾病的临床症状轻重不一，大多表现为慢性进行性溶血性贫血•本病以地中海沿岸国家和东南亚各国多见，我国长江以南各省均有报道，以广东、广西、海南、四川、重庆等省区发病率较高，在北方较为少见病因和发病机制•本病是由于珠蛋白基因的缺失或点突变所致。组成珠蛋白的肽链有4种，即α、β、γ、δ链•α地中海贫血大多数α地中海贫血是由于α珠蛋白基因的缺失所致•β地中海贫血β地中海贫血的发生主要是由于基因的点突变白血病白血病是一类常见的造血系统恶性疾病。特点为白细胞及其前身幼稚细胞在骨髓或其他造血组织中弥漫性地异常增生，进而浸润人体组织器官，产生各种症状急性白血病的分型1.急性非淋巴细胞白血病M1（急性粒细胞白血病未分化型）M2（急性粒细胞白血病部分分化型）M3（急性早幼粒细胞白血病）M4（急性粒一单核细胞白血病）M4Eo（伴嗜酸性粒细胞增多的粒一单核细胞白血病）M5（急性单核细胞白血病）M6（急性红白细胞）M7（急性巨核细胞性白血病）2.急性淋巴细胞白血病共分3型。L1L2L3慢性白血病的分型1.慢性髓系白血病慢性髓细胞白血病慢性嗜中性粒细胞白血病慢性嗜酸性粒细胞白血病2.慢性淋巴细胞白血病融合基因（1）BCR/ABL-P210，BCR/ABL-P190（2）PML/RARa-L，PML/RARa-S（3）ETO/AML（4）MLL/AF4（5）TEL/AML1（6）PBX1/EA2（7）CBFB-MYH11（8）HOX-11L2（9）SIL-TAL1急性淋巴细胞性白血病TEL/AML1急性粒细胞白血病ETO/AML急性早幼粒细胞白血病PML-RARa慢性粒细胞白血病BCR-ABLTBP内参内参即是内部参照可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正临床PCR检验注意的问题临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法标本采集•标本采集时间对扩增检测结果的影响•标本采集部位的准备•采样质量的评价•采样及运输容器•标本采集中的防污染临床标本的处理和保存•血清（浆）•全血•外周血单个核细胞•痰•棉拭子•脓液•体液•乳汁•组织血清（浆）•DNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大•RNA测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制，且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期（1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存应在-70℃下全血•以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使用肝素•全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA外周血单个核细胞•外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞•外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存于-70℃下痰•痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定标本•痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时,需对样本进行初步处理，即用1mol/LNaOH或变性剂液化•如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。•液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70℃下棉拭子•在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置5～10分钟,待大块状物下沉后,取上清立即离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。•如不立即用于核酸提取,则需保存于-70℃下.脓液•脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取DNA；水样的脓液则直接离心,沉淀用生理盐水洗2～3次后,即可用于DNA提取•对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上清立即离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按上述直接离心取沉淀即可。•沉淀标本的保存条件同样为-70℃体液•临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本的方式离心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本的保存同上。乳汁•乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBVDNA、HCVRNA、结核分枝杆菌和布鲁氏菌等的PCR检测。•提取方法：乳汁标本置4℃冰箱过夜→取100ul中清液→10000rpm/min离心10分钟→尽可能去除奶酪（建议用棉签蘸去）→弃上清加50ulDNA提取液→沸水浴10分钟→10000rpm/min离心5分钟→取5ul上清点样扩增。组织•组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处理步聚首先用生理盐水洗两次,然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水后剧烈震荡混匀,离心，弃上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。新鲜组织最好是保存于50%乙醇中,具体作法是，先用生理盐水将组织洗一次,切成宽度小于1cm的小片,加入适量的生理盐水,然后,边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%.这样固定的组织标本室温下可保存数日,4℃可保存6年。•石蜡切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脱蜡,再用蛋白酶K消化后即可进行DNA提取临床标本中PCR反应抑制物•内源性的:免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。•外源性的:如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。常见的核酸提取方法煮沸法柱提取磁珠法一步法二步法裂解方法煮沸煮沸化学裂解化学裂解分离方法离心离心亲和吸附吸附或杂交步骤1.煮沸裂解2.离心，去除大分子的抑制物3.取上清扩增1.煮沸裂解2.离心弃上清，浓缩标本并去除小分子抑制物3.离心，取上清扩增，去除大分子抑制物。1.化学裂解2.过柱吸附3.洗涤4.洗脱5.取洗脱液扩增1.化学裂解2.加磁珠吸附3.洗涤4.洗脱5.取洗脱液扩增抗干扰能力差较差好最好提取物组分较小分子量的混合物与核酸相似分子量的混合物全核酸特定病原的核酸自动化程度手工手工手工或自动半自动或全自动RNA提取的独特性•临床标本及实验室环境中,存在大量对RNA具有强烈降解作用的RNase，而RNase较耐高温,不易失活。•如何避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解,是保证RNA成功提取的关键之所在。RNA提取所用器皿的处理•经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管,离心管等基本上无RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。•实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必须于180℃干烤8小时以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其它用品。•DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于37℃下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15分钟，最后高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。RNA提取所用溶液的准备•对于RNA提