药典三部(2015版)-通则-3407外源性DNA残留量测定法

3407外源性DNA残留量测定法在进行外源性DNA残留量测定时，可根据供试品具体情况选择下列任何一种方法进行测定。第一法DNA探针杂交发供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定条件下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供试品中外源性DNA残留量。试剂⑴DNA标记和检测试剂盒⑵DNA杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜。⑶2%蛋白酶K溶液称取蛋白酶K0.20g，溶于灭菌水（电阻率大于18.2MΩ·cm）10ml中，分装后贮藏于﹣20℃备用。⑷3%牛血清白蛋白溶液称取牛血清白蛋白0.30g，溶于灭菌水（电阻率大于18.2MΩ·cm）10ml中。⑸1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0）用适宜浓度盐酸溶液调pH值至8.0。⑹5.0mol/L氯化钠溶液。⑺0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）用10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至8.0。⑻20%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液用盐酸调pH值至7.2。⑼蛋白酶缓冲液（pH8.0）量取1mol/LTris溶液1.0ml（pH8.0）、5.0mol/L氯化钠溶液2.0ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2.0ml、20%SDS溶液2.5ml、加灭菌水（电阻率大于18.2MΩ·cm）至10ml。如供试品遇氯化钠溶液发生沉淀反应，可免加氯化钠。⑽TE缓冲液（pH8.0）量取1mol/LTris溶液（pH8.0）10ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2ml，加灭菌水（电阻率大于18.2MΩ·cm）至1000ml。⑾1%鱼精DNA溶液精密称取鱼精DNA0.10g，置10ml量瓶中，用TE缓冲液溶解并稀释至刻度，摇晃，用7号针头反复抽打，以剪切DNA成为小分子，分装后贮藏于﹣20℃备用。⑿DNA稀释液取1%鱼精DNA溶液50μl，加TE缓冲液至10ml。用于探针标记和阳性对照的DNA制备用于探针标记和阳性对照的DNA，由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可参考下述推荐方案进行，具体方法可参考《分子克隆实验指南》（［美］J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002）或《精编分子生物学实验指南》（［美］F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社，1998）。将待提取的细胞基质悬液的细胞浓度调整为每1ml约含107个细胞，如果为细菌，则将其浓度调整为每1ml约含108个细胞。量取悬液1ml，离心，在沉淀中加裂解液400ul混匀，37℃作用12～24小时后，加入饱和苯酚溶液450μl，剧烈振摇混匀，以每分钟10000转离心10分钟，转移上层液体，以饱和苯酚溶液450μl重复抽提1次；转移上层液体，加入三氯甲烷450μl，剧烈振摇混匀，以每分钟10000转离心10分钟；转移上层液体，加入pH5.2的3mol/L醋酸钠溶液40μl，充分混合，再加入﹣20℃以下的无水乙醇1ml，充分混合，﹣20℃以下作用2小时，以每分钟15000转离心15分钟；用适量﹣20℃70%乙醇溶液洗涤沉淀1次，以每分钟15000转离心15分钟，弃上清液，保留沉淀，吹至干燥后，加适量灭菌TE缓冲液溶解，RNase酶切，苯酚-三氯甲烷抽提，分子筛纯化DNA，即得。用1%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法鉴定阳性对照品的DNA纯度；应无RNA和寡核苷酸存在；A260/A280比值应在1.8～2.0之间（测定时将供试品稀释至A260为0.2～1.0）。用于阳性对照和标记探针的DNA在使用前应进行酶切或超声处理，使其片段大小适合于DNA杂交和探针标记。阳性对照品的DNA浓度按下式计算：DNA浓度（μg/ml）=50×A260阳性对照品可分装于适宜的小管中，﹣20℃以下保存，长期使用。探针的标记按试剂盒使用说明书进行。测定法⑴蛋白酶K预处理按下表对供试品、阳性对照和阴性对照进行加样，混合后于37℃保温4小时以上，以保证酶切反应完全。加样量2%蛋白酶K溶液蛋白酶缓冲液3%牛血清白蛋白溶液加水至终体积供试品100μl1μl20μl200μlD1100μl1μl20μl适量200μlD2100μl1μl20μl适量200μlD3100μl1μl20μl适量200μl阴性对照100μl1μl20μl适量200μl注意事项供试品的稀释根据成品最大使用剂量，用DNA稀释液将供试品（原液）稀释至每100μl含1人份剂量；如成品最大使用剂量较大，而供试品的蛋白质含量较低，可用DNA稀释液将供试品稀释至每100μl含1/10人份剂量或每100μl含1/100人份剂量。D1、D2、D3为稀释的阳性DNA对照。用DNA稀释液稀释至每1ml中含DNA1000ng，然后依次10倍稀释成10ng/100μl（D1）、1ng/100μl（D2）、100pg/100μl（D3）3个稀释度；如成品使用剂量较大，而且DNA限量要求（100pg/剂量）较严格时，则需要提高DNA检测灵敏度，相应的阳性DNA对照应稀释成100pg/100ul（D1）、10pg/100ul（D2）、1pg/100ul（D3）三个稀释度。阴性对照为DNA稀释液，空白对照为未进行蛋白酶K预处理的TE缓冲液。当供试品1/100人份剂量大于100μl时，终体积也随之增大，一般终体积为供试品体积的1倍左右，供试品体积和终体积相差过小，可能会影响蛋白酶K的活性。2%蛋白酶K溶液和蛋白酶缓冲液的比例为1︰20，蛋白酶缓冲液和终体积的比例为1︰10。加入3%牛血清白蛋白溶液适量，是为了使阳性对照和阴性对照中含有一定的蛋白质，与供试品（通常为蛋白质）的酶切条件保持一致；如供试品为其他物质，则应改用其他相应物质。若预处理后的供试品溶液中的蛋白质干扰本试验，可用上述饱和苯酚溶液抽提法或其他适宜方法提取供试品DNA（阳性对照、阴性对照也应再次提取DNA，与供试品溶液平行）。无论采用何种方式抽取，Vero细胞DNA参考品至少应能达到10pg的检测限。供试品为疫苗制品时，供试品和阳性对照均采用TE缓冲液进行稀释。阴性对照为TE缓冲液。⑵点膜用TE缓冲液浸润杂交膜后，将预处理的供试品、阳性对照、阴性对照与空白对照置100℃水浴加热10分钟，迅速冰浴冷却，以每分钟8000转离心5秒。用抽滤加样器点样于杂交膜（因有蛋白质沉淀，故要视沉淀多少确定加样量，以避免加入蛋白质沉淀。所有供试品与阳性对照、阴性对照、空白对照加样体积应一致，或按同样比例加样）。晾干后可采用紫外交联法或置80℃真空干烤1小时以上。⑶杂交及显色按试剂盒使用说明书进行。结果判定阳性对照应显色，其颜色深度与DNA含量相对应，呈一定的颜色梯度；阴性对照、空白对照应不显色，或显色深度小于阳性DNA对照D3，试验成立。将供试品与阳性对照进行比较，根据显色的深浅判定供试品中外源性DNA的含量。第二法荧光染色法应用双链DNA荧光染料与双链DNA特异结合形成复合物，在波长480nm激发下产生超强荧光信号，可用荧光酶标仪在波长520nm处进行检测，在一定的DNA浓度范围内以及在该荧光染料过量的情况下，荧光强度与DNA浓度成正比，根据供试品的荧光强度，计算供试品中的DNA残留量。试剂⑴1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH7.5）用盐酸调pH值至7.5。⑵0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH7.5）用10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.5。⑶TE缓冲液（pH7.5）量取1mol/LTris溶液（pH7.5）1.0ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH7.5）0.2ml，加灭菌注射用水至100ml。⑷双链DNA荧光染料按试剂使用说明书配制。⑸DNA标准品取DNA标准品适量溶于TE缓冲液中，制成50μg/mlDNA标准品，于-20℃保存。DNA标准品浓度根据下式计算：DNA浓度（μg/ml）=50×A260DNA标准品溶液的制备用TE缓冲液将DNA标准品配成0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml的标准品溶液。测定法精密量取DNA标准品溶液和供试品溶液各400μl于1.5ml离心管中，分别加入新配制的双链DNA荧光染料400μl，混匀后，避光室温放置5分钟。取250μl上述反应液于96孔黑色酶标板中，并做3个复孔。用荧光酶标仪在激发波长480nm、发射波长520nm处测定荧光强度。以TE缓冲液测得的荧光强度为本底，测定和记录各测定孔的荧光值。以标准品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归，求得直线回归方程（相关系数应不低于0.99），将供试品溶液的荧光强度代入直线回归方程，求出供试品中DNA残留量。注意事项⑴DNA残留量在1.25～80ng/ml范围内，本法线性较好，因此供试品DNA残留量在该范围内可定量测定；当DNA残留量低于1.25ng/ml时应为限量测定，表示为小于1.25ng/ml。⑵供试品首次应用本法测定时需要进行方法学验证，验证内容至少包括精密度试验和回收率试验。若供试品干扰回收率和精密度，应采用适宜方法稀释或纯化DNA（可参见本项目第一法）以排除干扰，直至精密度试验和回收率试验均符合要求。需要纯化DNA后再进行测定的供试品，每次测定均应从纯化步骤起增加回收率试验，并用回收率对测定结果进行校正。