细胞凋亡检测方法

1大连海洋大学发育生物学期末论文题目：细胞凋亡的检测方法学生姓名：王英学院：水产与生命学院专业：海洋生物学学号：2015070703131指导教师：李霞二〇一五年十一月2摘要细胞凋亡（apoptosis）即程序性死亡（programmedcelldeath,PCD），是生理性细胞死亡过程。细胞凋亡过程涉及一系列基因的激活、表达以及调控。凋亡在维持动物机体内环境稳态中扮演者重要的角色。细胞凋亡的准确检测是研究细胞凋亡相关机制，以及细胞凋亡在疾病中的应用很关键的步骤。本文综述了细胞凋亡的检测方法。分别从体外细胞凋亡检测方法和体内细胞凋亡检测方法进行了总结概括。并且分析了每种方法的优劣势，并在文章结尾对未来细胞凋亡的检测方法进行了展望。关键词：细胞凋亡；检测方法；研究进展3AbstractApoptosis(programmedcelldeath,PCD),isaphysiologicalcelldeathprocess.Cellapoptosisprocessinvolvesaseriesofactivation,expressionandregulationofgenes.Apoptosisinmaintainingbodyhomeostasisplaysaimportantrole.Apoptosisofaccuratedetectionmechanismisthestudyofcellapoptosis,andcellapoptosisintheapplicationofdiseaseisthekeysteps.Thispapersummarizesthemeasuringmethodofcellapoptosis.Respectivelyfrominvitrocellapoptosisdetectionmethodandcellapoptosisinvivodetectionmethodsaresummarized.Andtheadvantagesanddisadvantagesofeachmethodareanalyzed,aswellasapoptosisdetectionmethodinthefuturewasprospected.Keywords:Apoptosis;detectionmethod;researchprogress4目录引言............................................................11细胞凋亡的体外检测..................................................21.1细胞凋亡的形态学检测...............................................21.2细胞凋亡的DNA片段化检测..........................................21.2.1DNAladder.....................................................21.2.2TUNEL检测法...................................................21.2.3ELISA检测法...................................................31.3细胞凋亡的线粒体膜电位的检测....................................31.4细胞凋亡的相关基因的检测........................................31.4.1凋亡促进基因的表达检测........................................31.4.2凋亡抑制基因的表达检测........................................31.5细胞凋亡的流式细胞术检测........................................41.6细胞凋亡的钙离子浓度变化的检测..................................42细胞凋亡的体内检测................................................52.1AnnexinV.........................................................52.2SynaptotagminI-C2A..............................................52.3ApoSese..........................................................63细胞凋亡检测技术的展望............................................6参考文献............................................................7致谢............................................................85引言细胞凋亡这个概念最初由英国阿伯丁大学病理学教授JFKerr通过对肝脏细胞的研究提出的，又称为细胞程序性死亡[1]。它是一个主动的，受基因控制的生理病理反应。细胞凋亡涉及一系列基因的激活、表达以及调控，是细胞为了适应更好的生存环境而采取的一种主动性死亡的过程。细胞凋亡发生了明显的生态学改变，包括细胞皱缩，线粒体膜电位下降，染色体凝聚和DNA的片段化等。过量或过少的细胞凋亡均对机体有害。人类和动物的好多疾病的发生都与细胞凋亡有密切关系，若能恰当的加速或阻断细胞凋亡，可为有效防控凋亡相关疾病提供新的治疗途径[2]。因此细胞凋亡的检测是开展凋亡研究的关键步骤。11细胞凋亡的体外检测1.1细胞凋亡的形态学检测1972年Kerr等就是根据形态学的变化将凋亡细胞和坏死细胞区分开来的。由于在电镜下能够观察到细胞结构在细胞不同凋亡时期的变化，因此电镜用来区别凋亡与坏死[3]。细胞发生凋亡时细胞核表现缩小，染色质边缘化、凝集。凋亡晚期还会出现由核碎片与胞质内的部分细胞器混合在一起,且被细胞膜包裹形成的凋亡小体。DNA特异性燃料（Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI等）与DNA的A-T碱基区进行非嵌入式结合，从而使细胞核着色，在紫外光激发时会出现明显的荧光。（StrasserA，唐炳华等人已在文章中阐述了此点）通过荧光显微镜可观察到细胞染色质的形态学变化及膜结构与通透性的改变。从而鉴别细胞凋亡和细胞坏死及正常细胞。此法简便易行，可用于细胞涂片或滴片定性观察细胞凋亡现象，但观察凋亡细胞的形态特征耗时费力，所以不使用大量凋亡样本的检测。1.2细胞凋亡的DNA片段化检测1.2.1DNAladder细胞凋亡时，由于核酸内切酶被激活，DNA被切成50-300kb大小的片段，然后进一步分解成约180bp的整数倍的寡核酸片段。用琼脂糖凝胶电泳检测显示梯形条带，而坏死细胞DNA则被降解成弥散的条带。张广智、李帅等在《细胞凋亡的主要检测方法研究进展》中简洁总结。刘江红等人抽提细胞的DNA，确定样品中DNA的量和纯度运用到了此法。DNAladder被视为经典的检测细胞凋亡的指标,但DNA凝胶电泳特异性虽高而灵敏度偏低,不适于检测细胞凋亡初期DNA链的轻微损伤。1.2.2TUNEL检测法TUNEL法最早由Gavrieli[4]于1992年引入，TUNEL法是一种将分子生物学和免疫组织化学相结合的原位检测凋亡细胞DNA片段的方法。其基本原理为:细胞发生凋亡时核酸内切酶被激活,染色质或DNA被核酸内切酶切割后产生180bp～200bp的含3′-OH末端的片断,脱氧核苷酸末端转移酶将结合有荧光素的核苷酸(dUTP)标记到缺口3-OH的末端,依次加入HRP抗荧光素抗体和HRP显色底物DAB,凋亡细胞显色明显,而正常细胞没有DNA断裂或者只有少量的DNA发生断裂,故不被显色[5]。但TUNEL法也有局限性。如:组织固定、处理的过程本2身会改变检测结果,对细胞凋亡不是特异性的,坏死细胞也会被标记。朱汉化等人用此法检测了细胞凋亡在《检测心肌细胞的凋亡与探讨》课题中。1.2.3ELISA检测法应用ELISA方法也可以检测DNA片段化,在凋亡的早期DNA发生断裂,核小体释放进入细胞质中,核小体是染色质的基本单元,通过ELISA检测凋亡细胞释放到细胞质中的核小体从而确定细胞凋亡程度[6]。此方法既可定性又可以定量,而且适合检测大批量样本,不需要特殊的仪器。ELISA可用于贴壁培养细胞、悬浮培养细胞、血清、血浆等的检测。该方法可检测早期细胞凋亡,灵敏度高,适用于多样本。FRANKFURTOS,KRISHANA运用酶联免疫法快速的检测到凋亡细胞并对凋亡细胞作用的药物进行了筛选。1.3细胞凋亡的线粒体膜电位的检测线粒体膜电位是由线粒体内膜两侧质子的不对称分布而形成的电化学梯度,在细胞凋亡过程中常因膜孔道大小的改变及转膜电位的降低来调节细胞凋亡[7,8]。线粒体膜电位的降低是细胞凋亡的早期事件。而且一旦线粒体膜电位耗散,凋亡就不可逆转。线粒体膜电位变化的检测属于电化学的方法,使用时需始终保持平衡染液pH的一致性。1.4细胞凋亡的相关基因的检测1.4.1凋亡促进基因的表达检测caspases家族基因表达产物是促进细胞发生凋亡的主要酶类,细胞凋亡机制的执行基本都是由一个进化上保守的caspase完成的。在凋亡中根据其作用及扮演的角色不同,caspase可以分为2类,启动caspase和执行caspase。启动caspase包括caspase8、9、10,执行caspase包括caspase3、6、7。其中caspase8和10外源性细胞凋亡的启动者,caspase9是内源性细胞凋亡的启动者[9]。不同的细胞系与不同的凋亡刺激因素会引起不同种类的caspases活化。因此,不同的细胞凋亡,也需要选取不同的caspase来检测,最终确定凋亡促进基因的表达情况[10]。李超等人在《细胞凋亡与研究进展》中通过此法进行了细胞凋亡的检测。1.4.2凋亡抑制基因的表达检测通过通常在检测细胞凋亡试验中,除检测凋亡促进基因的表达外,还会同时检测抑制凋亡基因的表达情况来反映细胞凋亡,如核因子-κB(NF-κB),环氧合酶(COX)和BCL-2家族成员等基因。NF-κB是调节细胞基因转录的关键因子,它参与了多种凋亡相关基因的表达,目前已发现NF-κB可促使某些抗凋亡基因表达3上调。COX定位于内质网附近并普遍存在于多种组织细胞内,促使生理性前列腺素的合成,以维护细胞自身稳定和调节正常组织细胞的一些生理活动[11]。Bcl-xL和Bcl-2是BCL-2家族中的成员,它们在抗凋亡中均发挥了重要的作用,但在不同的细胞类型和不同的死亡信号作用过程中,两者发挥的作用并不相同。而且当细胞内BCL-2抗凋亡成员的表达量增加时,线粒体通透性的改变和促凋亡蛋白的释放所带来的促凋亡作用可以被其抵消掉[12]。BeeviS等用RT-PCR检测促凋亡基因p53、Bax和Caspase-3和抑制凋亡基因Bcl2和Bcl-XL的表达,进而确定了胡萝卜提取物对人类癌细胞增殖和凋亡的影响。1.5细胞凋亡的流式细胞术检测流式细胞分析法可对单个细胞或其它生物微粒进行快速定量分析与分选，是定量检测细胞凋亡的重要方法之一.。流式细胞术主要包括多种方法，其中AnnexinV/PI法是目前较为流行的检测细胞凋亡的方法。细胞凋亡时磷脂酞丝氨酸(phosphatidy卫-serine,PS)由细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧。An-nexinV是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，对PS具有较高亲和性。它可以较为敏感地检测细胞膜表面的翻转的PS，可特异结合异硫氰酸荧光素(FITC)而保持细胞