细胞因子诱导杀伤细胞分泌因子影响人肝癌干细胞的凋亡

中国组织工程研究第20卷第14期2016–04–01出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchApril1,2016Vol.20,No.14ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH2033·研究原著·闪海霞，女，1982年生，河南省开封市人，2008年南方医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事感染性疾病及肝病方面的研究。通讯作者：翟玉峰，主任医师，南阳市中心医院感染性疾病科，河南省南阳市473000中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)14-02033-07稿件接受：2016-02-16细胞因子诱导杀伤细胞分泌因子影响人肝癌干细胞的凋亡闪海霞，范崇桂，霍丽亚，张怀宏，翟玉峰(南阳市中心医院感染性疾病科，河南省南阳市473000)引用本文：闪海霞，范崇桂，霍丽亚，张怀宏，翟玉峰.细胞因子诱导杀伤细胞分泌因子影响人肝癌干细胞的凋亡[J].中国组织工程研究，2016，20(14):2033-2039.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.008ORCID:0000-0002-8672-7109(翟玉峰)文章快速阅读：文题释义：杀伤细胞：是细胞表面具有IgG的Fc受体，当靶器官细胞与相应的IgG结合，杀伤细胞可与结合在靶细胞上的IgG的Fc结合，从而使自身活化，释放细胞毒素，裂解靶细胞。细胞凋亡：指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。摘要背景：采用自体免疫细胞进行免疫治疗已发展为治疗恶性肿瘤的主要辅助手段之一，但其作用机制尚未阐明。目的：探讨细胞因子诱导的杀伤细胞分泌因子对人肝癌干细胞凋亡的影响。方法：采用无血清悬浮细胞培养法富集获得人肝癌干细胞；以γ-干扰素、CD3单克隆抗体和重组人白细胞介素2诱导肝癌患者外周血单个核细胞产生细胞因子诱导的杀伤细胞。将第1代肝癌干细胞分为2组，对照组单纯进行肝癌干细胞培养，实验组将细胞因子诱导的杀伤细胞与肝癌干细胞共培养，培养48h后用流式细胞仪检测肝癌干细胞的凋亡情况，RT-PCR和Westernblot检测凋亡相关基因caspase-3mRNA与蛋白的表达。结果与结论：①对照组的肝癌干细胞凋亡率显著低于细胞因子诱导的杀伤细胞组(P0.05)。②实验组的促凋亡相关基因caspase-3mRNA和蛋白表达显著高于对照组(P0.05)。③实验结果表明，细胞因子诱导的杀伤细胞会明显促进肝癌干细胞的凋亡，并显著上调肝癌干细胞促凋亡相关基因caspase-3mRNA和蛋白的表达水平。关键词：干细胞；肿瘤干细胞；肝癌干细胞；肝癌；杀伤细胞；细胞凋亡；caspase-3主题词：肝肿瘤；肿瘤干细胞；细胞因子诱导杀伤细胞；细胞凋亡；组织工程细胞因子诱导杀伤细胞分泌因子与人肝癌干细胞的凋亡肝癌干细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养Transwell培养小室流式细胞仪检测肝癌干细胞的凋亡RT-PCR法检测caspase-3mRNA的表达Westernblot法检测caspase-3蛋白的表达结论：细胞因子诱导的杀伤细胞可明显促进肝癌干细胞的凋亡闪海霞，等.细胞因子诱导杀伤细胞分泌因子影响人肝癌干细胞的凋亡P.O.Box10002,Shenyang110180:ZhaiYu-feng,Chiefphysician,DepartmentofInfectiousDiseases,NanyangCentralHospital,Nanyang473000,HenanProvince,ChinaCytobine-inducedkillercellspromoteapoptosisofhumanlivercancerstemcellsShanHai-xia,FanChong-gui,HuoLi-ya,ZhangHuai-hong,ZhaiYu-feng(DepartmentofInfectiousDiseases,NanyangCentralHospital,Nanyang473000,HenanProvince,China)AbstractBACKGROUND:Immunotherapywithautologousimmunecellshasbeendevelopedasamajoradjuvanttherapyformalignanttumors,butitsmechanismofactionhasnotbeenelucidated.OBJECTIVE:Toinvestigatetherelationshipbetweencytokine-inducedkillercellsecretionandapoptosisinhumanlivercancerstemcells.METHODS:Humanlivercancerstemcells,HepG2cells,wereisolatedandenrichedusingserum-freesuspensionmethod.Theperipheralbloodmononuclearcellsfrompatientswithlivercancerwereinducedbyγ-interferon,CD3monoclonalantibodyandrecombinanthumaninterleukin-2toformkillercells.Passage1livercancerstemcellsweredividedintocontrolgroup(culturealone)andexperimentalgroup(co-cultureofcytokines-inducedkillercellsandhumanlivercancerstemcells).At48hoursafterculture,apoptosisinhumanlivercancerstemcellswasdetectedusingflowcytometry,andexpressionofcaspase-3mRNAandproteinwasdetectedusingRT-PCRandwesternblot,respectively.RESULTSANDCONCLUSION:Theapoptoticrateinthecontrolgroupwassignificantlylowerthanthatintheexperimentalgroup(P0.05).Theexpressionsofcaspase-3atmRNAandproteinlevelswerebothhigherintheexperimentalgroupthanthecontrolgroup(P0.05).Experimentalfindingsshowthatcytokines-inducedkillercellscansignificantlypromoteapoptosisinhumanlivercancerstemcells,andup-regulatethecaspase-3mRNAandproteinexpressionsdramatically.Subjectheadings:LiverNeoplasms;NeoplasticStemCells;Cytokine-InducedKillerCells;Apoptosis;TissueEngineeringCitethisarticle:ShanHX,FanCG,HuoLY,ZhangHH,ZhaiYF.Cytobine-inducedkillercellspromoteapoptosisofhumanlivercancerstemcells.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(14):2033-2039.0引言Introduction肿瘤是当今世界威胁人类健康的主要疾病之一，其发病率仅次于心血管疾病。尽管人类在肿瘤的治疗上已经取得重大进步，但在过去的20年，所有肿瘤的5年期存活率只提高了10%左右，恶性肿瘤的转移和复发仍无法得到有效控制[1]。化疗和放疗等方法会导致患者机体免疫力下降[2]。近年来，随着分子细胞生物学的发展，免疫学理论不断丰富，现代免疫学技术也在不断地推陈出新，大量的肿瘤抗原尤其是T细胞可识别的肿瘤抗原不断被发现，人们从细胞和分子水平上对肿瘤与免疫系统的关系有了更深刻的认识，为肿瘤免疫疗法在临床上的应用奠定了坚实的基础[3-4]。免疫治疗过程中，细胞因子诱导的杀伤细胞是一种常用的效应细胞，可以通过非特异性免疫的方式达到消灭病灶，治疗疾病的目的[5]。肿瘤干细胞是肿瘤组织中极少数具有自我更新能力，能自我无限增殖的细胞。这群细胞有更强的侵袭、转移能力，能耐受常规的放化疗[6]。现有的肿瘤治疗方法主要是针对肿瘤组织内的大多数已经分化的细胞，而不是肿瘤干细胞，即使绝大多数肿瘤细胞被杀死，但只要有幸存的肿瘤干细胞，仍然会造成肿瘤的复发和转移[7]。为此，实验探讨细胞因子诱导的杀伤细胞分泌因子与人肝癌干细胞凋亡的关系及其对肝癌干细胞的影响，以肿瘤干细胞特有的分子标记为靶点，采用全新的免疫治疗方法去攻击肿瘤干细胞，以此来发展新的肿瘤免疫疗法，具有十分重要的临床意义。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计细胞实验与体外观察性实验。1.2时间及地点实验于2015年6至8月在南阳市中心医院实验室完成。1.3材料1.3.1外周血标本采集2例肝癌患者外周血，均经临床病理学确诊，患者凝血功能功能正常，未合并严重心、肝、肾功能异常。1.3.2实验细胞、试剂和仪器肝癌HepG2细胞由南阳市中心医院标本室提供。实验用主要试剂：高糖DMEM完全培养液(北京清大天一科技有限公司)，表皮生长因子(天津润泰科技发展有限公司)，碱性成纤维细胞生长因子(生兴生物技术(南京)有限公司提供)，鼠抗人GAPDH单克隆抗体(上海拓然生物科技有限公司)，B27(北京沃比森科技有限公闪海霞，等.细胞因子诱导杀伤细胞分泌因子影响人肝癌干细胞的凋亡ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH2035司)，白血病抑制因子(上海晨易生物科技有限公司)，青霉素(上海晨易生物科技有限公司)，链霉素(上海天呈医流科技股份有限公司)，羊抗人caspase-3多克隆抗体(上海根生生物科技有限公司)，胰蛋白酶(北京格源天润生物技术有限公司)，重组人白细胞介素2(杭州沃森生物技术有限公司)，碘化丙啶(上海前尘生物科技有限公司)，PBS(北京诺博莱德科技有限公司)，辣根过氧化物酶(上海元龙生物技术有限公司)，RPMI1640培养液(上海常斤生物科技有限公司)，驴抗羊IgG(上海万疆生物科技有限公司)，干扰素γ(上海凯茂生物医药有限公司)，硝酸纤维素膜(Bio-Rad公司)，异硫氰酸荧光素(Promega公司)。实验用主要仪器：CO2培养箱(上海三腾仪器有限公司)，Transwell培养小室(北京恒泰丰科试验设备有限公司)，超低黏附培养板(美墨尔特(上海)贸易有限公司)，紫外高效分析仪(上海济成分析仪器有限公司)。1.4实验方法1.4.1肝癌干细胞培养与鉴定将肝癌H