细胞学研究科学上的偶然与必然

1从细胞染色形态鉴别到病因学研究的启示曹兴午题记：在每一个实验室进行细胞形态学的观察者，没有一个人不想你观察的形态学结果都与疾病的病因学相关联，一方面体现观察与研究的价值，另一方面是配合临床取得满意的结果，给患者带去佳音，下面的故事有久远、有现代，但，不妨一睹。【导读】历史的长河中生生不息，人们不断探索着大自然的奥秘，实现着伟大梦想。在科学研究中，科学家常常在一些偶然机遇中得到发现，受到启迪，这些与传统观念认识不同的发现，往往促使科学家加速完成了原定的目标，或者使研究改变目标而成为新起点。这些在科学史上的不乏事件，常常可以给后来者以极大的启迪，可能是你一生收益的财富。关键是人们有没有敏锐的扑捉机会的能力，有没有敏锐的观察力，有没有不怕挫折的心理承受能力和决心实践，去探索科学上的偶然性与必然性的内在联系，是科学研究者追求的动力和精神境界。一、结核杆菌染色的发现的故事18世纪，全球鼠疫、天花、霍乱、结核等微生物流行性传染病，肆虐全球，人类不断传来大量死亡噩耗，人心惶惶、生活不可终日。当时肺结核是全球死亡率最高的疾病之一，当时传统的观点认为：“结核病是一种遗传病，或是某种形式的癌症”。直到1882年，德国医生兼微生物学家科赫发现了隐藏的人类背后的致病元凶——结核杆菌，是一种变化无序、容易繁殖、容易传播的细菌。科赫的发现彻底改变了人们的传统认识，为医学研究与预防开辟了新的理念、新的方法、新的道路。罗伯特.科赫（RobertKoch1843-1910）德国医生、细菌学、现代微生物学奠基人之一。因为发现结核菌和结核菌素而获得1905年诺贝尔生理与医学奖。科赫年轻时曾经幻想成为一名漫游全球的航海家，或者是热带丛林的猎手。他幼年喜欢收集植物、矿物标本。1862年进入格丁根大学初选植物、物理、数学等，后来学医。由于勤奋好学，受到多位学者们的爱戴与青睐。毕业后他选择了到农村去，做一名乡村医生的职业。每天除去给村民看病以外，就是不分昼夜地对细菌着迷进行研究，这一切使他终于成为一名航行在生物界细菌学海洋里专门捕捉各种致病菌的出色猎手，成为世界著名的细菌学家。1870年参加了普法战争，发现了炭疽的肆虐，导致了许多战士的死亡，当时不得其解，乌云笼罩着战场与军营。1876年科赫经过刻苦的努力，终于分离出了炭疽杆菌，发现炭疽杆菌能够形成芽孢，为治疗预防炭疽病起到了不可磨灭的作用。随后开始对其他疾病的研究，以寻找病原体为出发点。他实践实验室与临床的结合，他奠定了许多细菌学研究的原则，设计了许多新技术和新方法。当时生活已经非常困难时，在他30岁生日那天，他妻子为了支持他的研究，用家中仅有的积蓄给他买了一台显微镜。他看到了真是喜出望外，欣喜若狂地对他妻子说：“谢谢你对我的支持！我一定做出成绩来”。从此科赫废寝忘食地，从宏观世界掘取到走进了微观世界的寻觅、观察和探索。在操作技术方法中进行了大胆的尝试与改进，创造发明了细菌悬滴标本检查法、显微镜油浸法（油镜检查）、显微镜摄影术、组织切片染色法、培养基和培养方法等等诸多的创造与发明。成为一位名副其实实验室方法学的开拓者，这也是科学研究往往都是从技术和方法领域开始的，从某种意义上说：科学的本质就是技术，技术的本质是推动科学研究进步的有利手段。所以，莫轻视技术领域的创新与改造，也许一个小小的改造可能导致进入“柳暗花明又一村”的境地，这在科学技术的长河中，屡见不鲜。当时结核病肆虐，无情地折磨着人们，夺去了许多人的生命，他孜孜不倦、废寝忘食，花去了6年时间，完成了用土豆为原料制作培养基，可以对细菌进行培养繁殖生长，他是世界上第一个发现“琼脂固体培养基”的人，直到今天，各个医院细菌实验室室仍然继续在使用，虽然现代已经是商品化，但，他的功绩不可没。21882年3月24日在柏林召开的生理学大会上，科赫首次指出：大约1/7的人死于结核病，其死亡率极高，而且许多结核病患者都是大有作为的中年人。肺结核患者的痰可以传播结核菌。为此，后人一直纪念着这位首先发现结核病的伟大的先驱——科赫，对人类抗击结核病的贡献。二、科赫的研究跌入低谷——巧遇有心人埃尔利希的故事由于细菌体积非常微小，而且透明无色，即使用当时最好的显微镜也只能观察到细菌的形态与大小，却看不到它们的内部结构。科赫想：能不能给小小的细菌穿上各种各样色彩鲜艳的衣裳？让我们可以根据穿衣裳的颜色进行辨认与鉴别，就是这样灵机一动，促使他的实验室变成了染料店。一次、二次，几十种染料都试验过了，细菌仍然是个模糊的身影，这时科赫陷入一筹莫展的困境，进入实验的低谷，甚至决定放弃了研究。於是他提出了放弃的结论。这是科学研究者常常出现的一种晦暗心理，往往在于坚持、坚持曙光就在前面。科赫在他的报告中提到了结核菌不容易染色的特点，引起了座在下面听讲的埃尔利希（PaulEhrlich1853-1915）注意（有心人可以发现别人没有注意的问题，有心人的听者则如获至宝）。在报告后，埃尔利希立即尝试采用肺结核患者的痰进行涂片染色，按照科赫的方法染色一直没有获得满意的结果，在几十、上百次失败以后埃尔利希也陷入了一筹莫展的境界，当他在显微镜下，看到的仍然是没有染色的裸菌体，光光的什么也分辨不出来，更不要说从形态特征区分鉴别菌类型了。看完染色不成功的痰涂片时，他垂头丧气、已经是夜深人静，无精打采，无奈地随手将不成功的染色载物片放在已经熄灭的火炉上。次日清晨，女仆来生火，当炉子生着后，放在炉子上的载物片由于受热，加速了细菌的着色。当埃尔利希从炉台上取下载物片，心不在焉地、无意中将载物片放在显微镜下观察时，他感到了极大的震惊、欣喜若狂地惊呼：我的天呀！！整个涂片布满了红色的结核菌。这一偶然发现大大促进了科赫对结核菌的研究，使他从结核病的后果的描述，跳跃到病因学的研究中，从而加速了对结核病的诊断和预防研究。这就是一直沿用的结核菌抗酸染色的发现与建立。这就是我们采用的加热染色的发现，以后有很多染色均有加热步骤，如铁-苏木素染色，起到促染的作用。多么可贵的启迪：一个偶然进入了必然——从后果的描述进入病因学研究。三、细胞染色的鼻祖——科学研究没有止境埃尔利希（PaulEhrlich1853-1915）的偶然发现成就了他们的必然结果。从此他成为了科赫的弟子，受到了科赫的器重与培养，成为了世界优秀的科学家。1908年获诺贝尔生理学与医学奖。先后获世界各学术团体授予的81个荣誉称号。埃尔利希的研究发现，不仅是给细菌可以穿上“衣裳”，使他得到了启示是：生物体对染料具有亲和力，生物体内不同的组织、细胞，被染色的能力不同或者说着色有不同的区别的一个客观规律，这为我们提供认识微观世界中细胞形态的有利武器。这一理论上的认识与提高，使他对生物学的染色方法和染色剂的研究，由此便一发不可收拾。他发明了生物活体的染色方法。在细胞学和组织学的染色中，发现了染料可以鉴别出酸性、碱性、中性三类。这为以后的白细胞分类打下了理论基础和实用的价值，也就是当前在血液细胞学一直沿用的经典方法，至今沿袭不衰。1877-1878年报道了鉴别了肥大细胞（组织中含有嗜碱性胞浆颗粒的细胞）与浆细胞（淋巴系统的细胞，其嗜碱性细胞浆内含表面粗糙的内质网），1879年发现了嗜酸性粒细胞的形态学特点与意义。他根据染色的方法，依据细胞形态学特征，首先鉴别了骨髓细胞白血病的各种类型，第一次提出白细胞应该按所含颗粒染色特性的分类方法，一直延续至今仍然沿用。继续研究鉴别了白血病与贫血的不同。更将染色的方法用于疟原虫。1891年采用美蓝为活性染色剂进行神经节细胞、神经末梢的染色。一系列的辉煌成就，使的细胞形态学3越进了一个高度，使形态学观察与病因学联系在一起，推进了实验诊断学与临床之间的联系，促进了医学发展的进程。历史的经验值得我们学习与借鉴，作为检验事业是不可缺少的动力。埃尔利希提出创侧链学说。这是抗体形成机制的早期学说之一。认为机体细胞像一个中央原子群（也称机能核），其周围侧锁（也称受体）。这种受体是细胞和其周围体液的生理接触点。这是埃尔利希借鉴化学家费希尔“锁与钥匙”学说，认为细胞具有侧链（后来他改称为受体）大分子。认为当细胞受到毒素（抗原）的作用后，由于受到刺激便产生大量受体，并自细胞脱落至血流中中和毒素，即为抗体。他深入研究动物血清的溶血反应，提出了补体概念。虽然他的理论引起了一些争论，但A.P.瓦瑟曼（AugustPaulWassermann1866-1925）1896年他用假单胞杆菌做试验，支持了埃尔利希的侧链学说。1906年瓦瑟曼就是依据埃尔利希学说，设计了检测梅毒患者体内抗体的补体结合试验（也就是瓦瑟曼实验的诞生）：若患者血清中有梅毒抗体存在，则进入梅毒抗原后，抗原——抗体复合物便将补体结合，此时再加入溶血介质和红细胞也不会出现溶血，此即瓦瑟曼氏反应，至今仍为梅毒诊断方法之一。而我们现在是用正常心脂抗原（牛心粉抗原）与可疑梅毒病人血清（或其他体液）作补体结合试验，以测定血清（或体液）中所含的抗体（反应素抗体），作为梅毒的辅助诊断方法。当然，随着科学技术的发展已经有更先进的方法取代，但，前人的功绩是不可磨灭的，我们应该敬仰与学习。历史上科学研究的成功者告诉我们：一种方法的建立可以创造一个科学发展的历史新阶段。而基础研究的提高与成功，必然促进临床诊断与治疗效果的提高，并促进整体医学水平的提高。开创性的研究是取得科学研究必然途径，是科学研究的核心与精髓，每个研究者必须抓着这一点，开启智慧的灵感，创造新成果。滴水穿石无非说明两点：目标一致；始终如一。持之以恒、耐住寂寞是每个成功者的秘诀。切忌浮躁更是科学研究工作的大忌。不能单纯满足在应用上，应该深入追求其原理，恰恰是我们缺乏的四、宫颈细胞学的研究40年代出现的宫颈细胞学涂片(ConwentionalPapSmear)，之后有了液基细胞学检查LBC、HPV检测、疫苗、等非常有意义的工作。欧洲生殖道感染肿瘤研究会在2010年统计全球100万正常细胞学HPV感染率的研究显示，全球为11.7%、非洲21.1%、美洲11.5%、欧洲14.2%、亚洲9.4%。我国HPV+细胞学已经成为防止宫颈癌发生的有利武器。其起点也是从宫颈细胞学涂片开始的，可以说是从细胞形态学向病因学一点一点探索、积累和总结认识的成果，任何研究都有起点，不断深入，认识事物的规律。五、当今睾丸生殖功能衰退与障碍——也从精液细胞学研究开始逐渐探讨病因1.精液细胞学的建立笔者生精细胞学是1984年开始在中日友好医院起步研究，当时集中在精液中精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子的形态、定性、定量的研究，更集中与白细胞的区分上面，进行了大量的两类细胞的区别与鉴定，特别是生精细胞的确定与分类上，经历了8年时间，我和8个学生日以继夜的完成，1992年完成《107例生育组与不育组精子形态与生精细胞定性与定量分析》中华医学检验杂志，1992,15（2）：86-89。在国内首次如此系统详细的报道，开创了精液生精细胞学检测的新时代[17]，论文获得中华医学会北京分会优秀论文奖。临床可以根据生精细胞的多少、比例，结合临床情况，进行诊疗。前后发表了20篇学术论文。逐渐国内外认同与接受，在我们的显微镜下，彻底摈弃了“白细胞或是圆形细胞”报告的时代，也算我们领先了一步吧！科学研究没有终点，永远在研究之路上。2006年根据多年收集和积累生精细胞形态学图片和精子形态学的资料，依据生精细胞凋亡的着眼点与思路，重新审视以往的结果，创新描述了生精细胞凋亡、胀亡的形态学特征和与疾病的关系，从实验室进入临床，为医学检验学增加新内容，为临床评估睾丸生殖功能4障碍提供了新途径，开拓了采用生精细胞学评估睾丸生殖障碍的新方法、新理念，为临床诊疗应用开启了新观念，全书图文并茂形式书写，主编《精液分析与不育症——生精细胞凋亡、胀亡与精子形态学图谱（中英对照）》（计80万字600幅图片）。是基础研究与临床结合新创举，检验与临床结合迈开的新步伐。2012年集生精细胞广泛内涵与睾丸病理学的进一步观察，主编完成《精液脱落细胞学与睾丸组织病理学》、《男性不育诊疗资料汇编》及参编《临床检验诊断学》等著作。晚近开创了精