细胞工程知识点

细胞工程：以细胞为主要研究对象，在组织、细胞、细胞器和分子水平上，运用工程学原理，按照预定目标，改造生物学性状、生产生物产品的应用型科学技术。研究内容1、组织、器官和细胞培养——利用生物体各部分组织、器官或者细胞进行离体培养（invitroculture）的技术。它是细胞工程的基本技术。2、动物胚胎工程胚胎移植——将动物体内发育的早期胚胎分离出来，将其移植到其它未受精母体子宫内，代孕产生个体的技术。试管动物——利用精子和卵子的体外受精（invitrofertilization,IVF），显微受精、胚胎体外培养和移植技术所获得的各种动物。3、染色体工程借助于物理、化学等方法，使某种生物染色体数目、结构和功能发生改变的技术。4、细胞遗传工程转基因动植物——用细胞工程结合基因工程方法将目的基因导入受体生物基因组中，在体内稳定表达，并稳定地遗传给后代。克隆动物——动物的无性繁殖，不经受精过程，复制出基因型、外形和性能一致的个体。5、细胞融合采用自然或者人工方法使两个和几个不同细胞或原生质体融合为一个细胞，用于产生新物种或品系及产生单克隆抗体。研究任务举例①细胞或者组织所需营养和环境条件；⑤动物胚胎移植；⑦改良生物品种；发展简史探索时期（1859－1929）；培养技术建立时期（1930－1959）；迅速发展时期（1960～）植物培养技术原生质体培养和细胞融合1971年Nagata等将烟草原生质体培养出再生植株；1972年Carlson用NaNO3进行了烟草原生质体融合；植物快繁技术花药培养技术次生物质生产传代:细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。原代培养:取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。细胞培养：使用单个细胞悬液组织培养：使用组织块（0.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫原代培养细胞的生命归宿：原代培养期——传代期——衰退期细胞株：细胞连续培养40－50代，仍然保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为，这种传代细胞称作细胞株；细胞系“永生性”：细胞连续培养40－50代后，大部分死亡，少量发生了遗传突变，带有癌细胞的特点，染色体呈亚二倍体或非整倍体，失去接触抑制，容易传代培养；培养细胞的生长方式贴附生长（动物细胞）：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞贴附生长细胞的生长过程游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。占时10分钟一4小时贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的表面附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）潜伏期此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性培养细胞生长的条件温度:37℃O2CO2:5%pH:7.2-7.4渗透压无污染无毒培养基:培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染合成培养基:是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）血清：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子③激素④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分有血清培养血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。球蛋白含量越低，质量越好；血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1）悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2）半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3）贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶和0.02%的EDTA混合消化液。1吸光培养瓶中的培养液2加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），静置2-10min（显微镜下动态监测）。3吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。7将后者放入培养箱中培养。细胞克隆形成率实验：单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞的增殖能力克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数缺点：操作繁琐优点：精确、可靠培养细胞活力测定方法1）台盼蓝法用0.5%的台盼蓝染液（PBS配制）少量同细胞悬液混合均匀后，在显微镜下观察；活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力2）四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。操作步骤（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制曲线细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。低温保护剂的应用1、在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果；2、常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法1、预先配制冻存液：含20%血清培养基10%DMSO2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5×106细胞/ml)3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4、4年后，存活率可达80％以上。DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。细胞复苏方法1.从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）；2.5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；3.低速离心10分钟；4.去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。植物细胞培养和体细胞杂交植物组织和细胞培养：植物的器官、组织或者细胞从植物分离后，在无菌条件下接种于人工配制的培养基上，使其细胞分裂、增殖、分化、发育，直至形成完整植株的过程。理论基础1902年德国植物学家Haberlandt：植物的体细胞在一定条件下，可以如同受精卵一样，具有潜在发育成植株的能力。细胞脱分化分裂成一团无特定结构和功能的松散的薄壁细胞团，称为愈伤组织细胞再分化：已经脱分化的细胞或者组织重新恢复分化能力，形成各种不同类型细胞的过程植株再生的两大途径1器官发生途径根芽器官发育成植株，2体细胞胚胎发生途径先产生具有胚芽、胚根的胚状体结构，再形成植株体细胞胚胎发生体细胞胚起源于一个非合子细胞，它经过胚胎发育形成胚状结构；它来源于体细胞离体培养过程，又称不定胚、无性胚，体细胞胚的维管组织同母体组织或者外植体的维管组织通常没有联系体细胞胚胎发生同器官发生的不同1体细胞胚胎具有双极性2生理隔离体细胞胚通过胚柄从外植体吸收营养；3体细胞胚胎遗传性相对稳定，体细胞胚基因型同亲本类似；4重演受精卵的发生过程重演合子胚发生途径，全能性最完全的体现。体细胞胚的来源1、器官外植体2、来自愈伤组织3、来自悬浮细胞4、来自单倍体细胞：从大小孢子诱导产生5、来自原生质体影响植物细胞形态发生的因素外因1.培养基1）生长调节物质根或者芽分化取决于IAA/CTK的比值，IAA、IBA促进壮根，但根数少；NAA促进根数，但根纤细；2）营养成分生根：要求无机离子浓度低；不加还原氮NH4＋；氮源也有重大作用：铵态氮有利于胚胎发生；有机氮也促进胚状体发生3）培养基的物理性质：渗透压：糖来调控；pH：5.6～6.0，固体培养有利于愈伤组织，液体培养有利于产生胚状体2.环境条件光照强度：1000－1500Lux；短波的蓝光促进芽分化，长波的红光促进根分化；温度：25°C，昼夜变温更有利于器官发生和生长内因：1、材料的基因型：烟草、胡萝卜容易诱导器官发生，禾谷类、棉花难诱导；2、个体发育年龄：外植体越幼嫩越容易诱导；3、愈伤组织生理状态：继代次数越多，器官分化能力越低植物离体无性繁殖：指利用组织培养方法进行植物离体培养，在短期内获得大量遗传性一致的个体的方法；又称微繁；意义：繁殖速度快，经济效益好；占有空间少，工厂化生产，不看天；繁殖珍稀资源，品种改造植物离体无性繁殖个体发生途径：1、不定芽型：选取具有顶芽或腋芽的短枝无菌培养，诱导其萌发成苗，或者产生更多的不定芽，再继代育成苗（快速、遗传稳定、缩短苗木的童年期）2、器官型从茎、叶等外植体上诱导不定芽或者诱导带芽的休眠器官（小球茎、小块茎），再育成植株。（百合、水仙等容易成功，速度较慢；遗传稳定）3、器官发生型先诱导外植体产生愈伤组织，再分化培养根、芽或胚状体，最后育成苗。水稻、小麦常以幼嫩花序为外植体（速度快，能得到大量愈伤组织；但容易发生变异，遗传不稳定）4、胚状体发生型外植体脱分化形成胚状体，再育成苗（胡萝卜、甘蔗、石刁柏速度快、数量多遗传稳定）离体无性繁殖方法1.外植体准备建立无菌外植体是非常重要的，根据材料不同选择适当的灭菌方法；根据文献选择合适的基本培养基，并考虑附加成分（主要为生长调控物质的筛选，包括种类和浓度2.组织增殖外植体在无菌培养基上大量快速增殖，选择合适的方法经过多次继代培养，扩增外植体产生的芽；培养基是关键，继代培养过程中要注意调整生长物质种类和浓度；控制生长，减少变异；3.植株再生将继代培养增殖的小芽，转移到生根培养基中，诱导根，最终形成