细胞抽提物诱导的体细胞重编程

姓名：朱秀生学号：1418302029专业：动物遗传育种与繁殖细胞抽提物诱导的体细胞重编程摘要：体细胞重编程是指在特定条件下将已分化的体细胞去分化逆转回原始多能状态或转分化为其他类型细细胞。目前体细胞重编程的方法主要有：体细胞核移植、细胞融合、特定转录因子转染、化学小分子诱导、细胞抽提物诱导等等。近年来细胞抽提物诱导越来越受到研究者的关注。利用该方法不仅可以获得需要类型的细胞，而且方便识别与重编程有关的细胞因子，探究重编程机制。关键词：重编程诱导细胞抽提物细胞在发育过程中，特异性地开放或者关闭某些特定基因，可以使细胞产生不同的表观状态。实验证明，通过重编程成熟体细胞的基因形态可以使其表观状态发生改变，也就是说分化的体细胞在特定的条件下能转为另一种细胞形态，此过程被称为体细胞的重编程。细胞抽提物诱导是重编程的方法之一，是指用供体细胞抽提物(Cellextract)作用于受体细胞后，使受体细胞表达供体细胞的特异性基因。本文就细胞抽提物重编程的研究现状、相关机理及存在的问题进行综述。1.细胞抽提物诱导的概述1.1细胞抽提物重编程的方法抽提物诱导体细胞重编程的步骤包括:收集待提取细胞，加入细胞裂解液，通过脉冲匀浆或离心获得细胞内容物;应用链球菌溶血素O(StreptolysinO,SLO)或洋地黄皂普(Digitonin)等细胞膜透化剂处理受体细胞，使受体细胞膜出现可逆性开放通道；然后受体细胞与添加了能量系统的抽提物共孵育；一定时间后用含Ca2+离子的培养液封闭受体细胞；进而将细胞接种于培养皿中继续培养，并观察重编程特征。1.2细胞抽提物重编程的机制目前抽提物诱导体细胞重编程的机制尚未明确普遍认为是抽提物中某些因子进入细胞内，发挥一系列作用，引起细胞染色质重塑、表观遗传修饰改变、基因表达开启与关闭从而使体细胞重编程。2000年，Kikyo等[1]用非洲爪蟾(Xenopuslaevis)卵母细胞抽提物处理爪蟾上皮细胞，开创了抽提物诱导体细胞重编程研究的先河。研究发现当与抽提物共孵育后，体细胞的蛋白组成发生变化，以TATA盒结合蛋白(TATAbingdingprotein,TBP)为代表的一类蛋白从细胞中擦除，以OCR2为代表的抽提物特有蛋白整合入体细胞内。更深入的研究发现，抽提物中染色质重塑复合体家族成员ISWI是引起体细胞TBP擦除的关键物质，揭示了ISWI在体细胞重编程中的重要作用。Hansis等[2]用非洲爪蟾卵母细胞和不同时期胚胎抽提物处理人239T细胞时发现，卵母细胞和早期囊胚抽提物均可使细胞重编程，表达多能性标志基因Oct4，而晚期囊胚抽提物无重编程能力，推测可能与晚期囊胚基因表达发生变化、重编程因子消失有关。同时他的研究还发现重编程能力随着抽提物中染色质重塑酶BRG1的去除而废止，推测BRG1也是一种能够使体细胞发生重编程的重要因子。Alberio等[3]研究发现当用爪蟾卵母细胞抽提物处理猪胎儿成纤维细胞后，在重编程过程中检测到体细胞核纤层蛋白A/C(LaminA/C)消失，爪蟾特有的核纤层蛋白III(LaminIII)整合入体细胞中，并且这种整合需要预先通透细胞膜，表明细胞膜的通透性可能是抽提物诱导重编程的关键因素。但目前对于抽提物诱导体细胞重编程的机制研究还不够深入，仅能发现个别物质对细胞重编程的作用，如何由点及而广泛的研究重编程调控网络还需继续深入研究。1.3重编程受体细胞的选择目前，受体细胞主要是成纤维细胞和成体干细胞，因为这些细胞在体内储量丰富、取材方便、易于分离培养，而且体外诱导条件卜都表现出多向分化潜能，都可以分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞等，这为体细胞重编程后的分化提供了理论支持。最近有研究表明，在特定的转录因子诱导下，角质形成细胞比成纤维细胞更容易去分化为多能干细胞，有效率约为成纤维细胞的100倍，且角质形成细胞重编程后的细胞的生长速度是成纤维细胞的2倍。在抽提物对体细胞的重编程中，角质形成细胞是否具有同样的优势，尚待研究证明。2.细胞抽提物的研究现状Gaustad等用大鼠心肌细胞抽提物处理人脂肪干细胞，3周后，40%的脂肪干细胞变成多核细胞，在培养过程中观察到细胞有自动节律性。同时，部分细胞表达。一肌动蛋白、连接蛋白43、肌钙蛋白等心肌细胞特有的表面蛋白，并表达分化细胞特有的核纤层蛋白A/C(LaminA/C)此外，在重编程过程中，处于G1期的细胞数量减少，细胞的增殖能力减弱。Hakelien等[4]将胰岛素瘤INS-lE细胞提取物转入渗透化处理过的成纤维细胞，成纤维细胞变为圆形，胞体和核变小。Insulin、Pdxl基因的表达在培养早期可检测到，维持7-9d后表达减弱直至消失、用胰岛素抗体可以检测到细胞内胰岛素蛋白的出现。但在葡萄糖的刺激下，细胞没有出现胰岛素分泌现象。Bru等[5]用小鼠胚胎干细胞抽提物转入人293T细胞。LaminA/C逐渐消失，1-8h后表达干细胞特有的与多能性相关的基因Nanog，Oct4，Sox2，c-Myc、和K114，这些基因的表达在培养过程中持续表达并逐渐加强，说明基因可以发生长期重编程、培养48h后这些基因表达的强度与ESCs相差较多，表明ESCs的抽提物启动了293T细胞向多能性状态的改变，但是没有完全分化为ESCs。Rajasingh等将小鼠的ESCs抽提物转入成纤维细胞中，3d后成纤维细胞的形态开始向ESCs变化，10d时即形成ESCs样克降；4周后，重编程的细胞高效表达Oct4，Nanog，SSEA1，SCF和c-Kit等ESCs标志物，并且在体外诱导条件下，细胞可以向心肌细胞、内皮细胞、神经元细胞和脂肪细胞分化将CM-DiI标记的重编程后的细胞应用至小鼠下肢缺血模型，术后7d，10d，14d观察，缺血卜肢的灌注明显增强，毛细血管密度显著增加，移植的细胞分化为血管内皮细胞和骨骼肌细胞、应用携带GFP基因的慢病毒转染重编程的细胞后，对急性心肌梗死小鼠进行心肌注射后发现心肌纤维化部位明显减少，左心室无显著扩张，心肌收缩功能较好，梗死部位边缘组织的毛细血管密度明显增加，移植的细胞转化为心肌细胞和血管内皮细胞。3.细胞抽提物诱导的进展目前，细胞抽提物重编程研究主要集中在细胞去分化、转分化和干细胞分化3个方面。3.1细胞去分化体细胞核移植实验已证实卵母细胞中有能够使体细胞重编程恢复全能性的全部物质，因此卵母细胞抽提物是研究细胞重编程的重要工具。非洲爪蟾、蛛鲸等两栖类动物由于其卵数量多、体积大、来源方便，是最初研究抽提物诱导体细胞重编程的理想材料。Miyamoto等用非洲爪蟾卵母细胞抽提物处理猪胎儿成纤维细胞，检测到爪蟾特有的组蛋白B4和LaminLIII整合到体细胞中，组蛋白H3K9去乙酞化，抽处细胞培养4d后表达多能性标志基因Oct4和Sox2，并形成类胚胎干细胞样的“克隆点”，细胞发生部分重编程。Ganier等的研究发现爪蟾卵母细胞抽提物对小鼠胎儿成纤维细胞有强大的重编程能力。当用M期抽提物处理受体细胞后，受体细胞短暂增殖，呈克隆样生长，并表达多能性标志基因。研究还发现抽提物处理与诱导iPS协同作用，可提高iPS诱导效率45倍。Bian等通过蛛鲸(salamandrae)卵母细胞抽提物诱导体细胞重编程，发现细胞基因组DNA甲基化、H3K9三甲基化水平降低H3K9乙酞化水平升高，Oct4基因启动子发生去甲基化，体细胞有去分化恢复多能性的趋势。2011年，Allegrucci等研究发现两栖动物卵母细胞抽提物可诱导乳腺癌细胞重编程，引起肿瘤抑制基因启动子去甲基化、使沉默基因重新表达。这也是首例应用抽提物诱导癌细胞重编程的报道，为癌症的治疗提供了新思路。但该研究发现重编程能力只存在于未成熟卵抽提物中，成熟卵抽提物没有重编程能力;并且在对蛛鲸和爪蟾卵抽提物重编程能力的比较中发现，前者的重编程能力要显著好于后者，推测可能是不同物种、不同时期的卵母细胞重编程能力有所不同。哺乳动物卵母细胞个体小，较难收集足量的抽提物，但对于同种属间的重编程研究，却是比两栖动物卵母细胞更好的实验材料。在体细胞核移植试验中，目前主要采用MII期卵母细胞作为核受体，因此认为MII期卵母细胞抽提物是研究重编程的理想材料；而不适合作为核受体的GV期卵母细胞是否对体细胞重编程有促进作用也可通过抽提物诱导验证。Bui等用小鼠GV期卵母细胞抽提物处理体细胞，体细胞核重塑，组蛋白H3K9完全去甲基化H3K9，H3K14部分去乙酞化，并且重编程后的体细胞有助于后续克隆胚胎的发育，因此认为GV期卵母细胞中也存在对重编程有重要作用的因子。Miyamoto等[6]分别用猪GV期和MII卵母细胞抽提物评估诱导体细胞重编程的能力，前者诱导激活多能性标志基因表达，细胞呈克隆样生长;后者重编程作用引起基因组H3K9去乙酞化、TBP消失，但没有明显的形态学变化，说明GV期和MII期卵母细胞都具有诱导体细胞重编程的能力，但二者可能具有不同的因子发挥不同作用，为重编程机制的研究和克隆胚胎的制备提供了新思路。3.2细胞转分化应用细胞抽提物诱导也可以使一种类型细胞直接转分化为另一种类型细胞，省略细胞去分化步骤，这将会提高细胞转化效率。Hakelien等用T细胞抽提物处理293T细胞，结果发现受体细胞转录因子富集，染色质重塑复合物激活，引起293T细胞表观遗传修饰改变，表达淋巴细胞特定基因和表而标志。而他的另一项研究发现INS-lE细胞抽提物可以短暂改变成纤维细胞命运，抽提物处理后受体细胞明显回缩，4周后表达p细胞特有的转录因子Pdx-1和insulin，有5%~30%的细胞检测到胰岛素标记。Choi等[7]报道大鼠胰腺抽提物处理鼠间叶细胞，处理后细胞呈胰岛样生长，表达4种胰岛特异表达激素(胰岛素、胰高血糖素、胰多肤和生长激素抑制素并对葡萄糖有应答反应，这种转分化得到的类胰岛细胞将为研究糖尿病提供大量材料。但目前对于抽提物诱导体细胞转分化的研究还较少，需进一步研究。3.3诱导干细胞分化干细胞的多潜能性为再生医学提供了巨大的前景，如何使干细胞高效定向发育，培养出所需类型的细胞，一直是干细胞研究的热点问题。传统诱导干细胞定向发育的方法主要包括生长因子介导、基因修饰、组织与细胞共培养等。随着抽提物诱导细胞重编程研究的不断深入，细胞抽提物诱导成为一种新兴诱导干细胞定向发育的方法。Qin等用II型肺细胞抽提物诱导小鼠胚胎干细胞、处理后的胚胎干细胞在培养过程中自发分化为I型肺细胞，且分化速度远快于细胞因子诱导。Liu等采用胎儿肺脏组织细胞抽提物诱导人胚胎干细胞向造血细胞系定向发育，结果显示抽提物诱导与传统的细胞共培养方式相结合可以大幅提高定向发育能力。唐新杰等用人表皮细胞抽提物重编程人脂肪干细胞，加入表皮细胞抽提物后受体细胞变为表皮细胞特有的“铺路石”样形态，并表达表皮细胞特有的KIl10及K19基因及膜蛋白，脂肪干细胞向表皮细胞定向分化。潘侃达用血管组织细胞抽提物诱导大鼠骨髓间充质干细胞，发现细胞基因表达发生变化，内皮细胞特异性基因CD31，CD34，CD144和eNOS呈高表达。Labovsky等[8]用新生大鼠心肌细胞抽提物诱导骨髓间充质干细胞，受体细胞表达心肌细胞特异基因，在诱导体系中加入DNA甲基化转移酶抑制剂5-aza可明显提高转分化效率。与基因修饰、组织共培养等传统方法相比，抽提物诱导法简单、操作性强，可作为直接工具或辅助手段诱导胚胎干细胞定向分化。4.细胞抽提物目前存在的问题及应用前景4.1重编程的有效率根据文献说明，细胞抽提物重编程的最高的有效率为90%，但是在重编程过程中需要连续更换多种试剂和培养液，这样就导致增殖细胞的选择性培养，无法准确估计重编程细胞的比例而且，长期的培养过程使得系统分析与重编程有关的因子及作用的难度增大因此，以简单高效的方法来实现细胞抽提物重编程，是需要进一步研究的的。4.2新基因表型的维持在抽提物处理细胞后，8小时内即可检测出目的基因的表达、目的基因的表达会在高峰期开始下降。有文献表明，重编程数月后还可以检测到新表型的表达，新表型的维持时间与受体细胞的类型和抽提物的来源有关。如何使重编程后