细胞生物学--细胞生物学教案doc

细胞生物学教学方案第一章序论第一节细胞生物学的特点123第二节细胞学和细胞生物学发展简史Aristotle的名言一细胞的发现RobertHookeA.V.Leeuwenhoek二细胞学说的建立SchleidenSchwann细胞学说的主要内容1.2.3.Virchow(1858)的名言12二细胞学的经典时期1原生质和原生质体概念的提出Mohll804原生质(protoplasm)1880原生质体(protoplasm)2细胞分裂的研究1841RemakamitosisFlemmingmitosisBenedenmeiosis3重要细胞器的发现Altmann1894mitochondrionGolgiGolgibady三细胞学的分支1遗传学的发展(1)Beneden1876精卵细胞染色体数只是体细胞染色体数的一半(2)1900Mendl孟德尔定律的重新发现(3)1905Wilson发现性别和染色体的关系Weissman预见遗传单位有次序的排列在染色体上(4)Sutton染色体学说染色体行为和遗传因子联系起来.(5)1910Morgan连锁基因图2细胞生理学3细胞化学四细胞生物学的形成与发展1953WatsonCrickDNA空间结构的发现六十年代细胞生物学产生七十年代细胞生物学教学的开展八十年代分子细胞生物学的发展九十年代分子细胞生物学高科技手段的发展和运用DNA指纹PCR技术杂交瘤技术的运用第二章细胞基本知识第一节非细胞形态的生命体1朊病毒(Prion)巴布亚新几内亚一土著库鲁病笑死症羊脑风牛病2类病毒3病毒第二节原核细胞1支原体2衣原体3立克次氏体4放线菌5细菌和蓝藻第三节真核细胞基本知识概要1三大系统2动植物细胞的比较第三章细胞生物学研究方法自1680年荷兰学者列文虎克(Leeuvenhoek)用单显微镜(单透镜)第一次看到酵母活细胞以来,人们一直在努力改革和发展观察手段，来研究细胞较深层次的形态和结构。今天人们已经有了具有原子尺度高分辨本领的扫描隧道显微镜。与此同时人们还创造了一系列对细胞组分和细胞生理活动进行详尽分析的方法和手段,它们揭示了各种细胞结构及生物大分子在细胞内的功能和作用。为了提供大量均一的细胞作为生物学的研究材料,人们又发展了一系列细胞培养技术。这些培养技术已经给人类带来了极大的利益。可以认为，细胞形态结构的观察技术，细胞组分及功能的分析技术及细胞培养技术是细胞生物学赖以发展的三大技术手段。在这里我们只能对某些具有代表性的实验技术的基本原理和技术特点作一简单的介绍。希望学生通过本章的学习不但能了解实验技术本身，还能够了解到细胞生物学这一实验科学的发展是和实验技术的进步休戚相关的,因此发展和开发先进的实验技术也是细胞生物学的一项重要内容。第一节细胞形态结构的观察方法一固定法与活体观察法固定法是以一定的化学物质的溶液(有时是气体)在尽可能保持细胞生活结构的情况下迅速杀死组织块。这一过程称为固定(Fixation)。然后制成薄切片,再染色(Staining)进行观察。这种方法比起观察活细胞有三个优点:第一,它能清楚地显现细胞的细微构造,如关于染色体,各种细胞器、细胞膜和细胞壁的微细构造都是靠这种方法阐明的。第二,这种方法的制片一般均能保存很久,便于前后研究各种现象之比较。第三,应用范围广,几乎可用于所有的组织细胞。这种方法不仅在细胞学发展的历史上发挥过很大作用,而且在现代细胞学中也是重要研究手段之一。例如用电子显微镜研究细胞亚显微结构时通常都使用固定法。固定法在细胞化学的研究上也有广泛的应用。固定法的缺点是,在用固定剂(Fixative)杀死细胞的同时,常常难免使细胞的某些生活结构发生一定的变形。因此这种方法不能完全如实地反映生活细胞的情况。在实践上往往是能保存细胞某种结构的固定剂,却不能使另一些结构保留下来。例如,适于观察染色体的固定剂,对于观察线粒体就不合适。有人因为固定法的这种缺点而对它抱怀疑主义的态度。这是过分偏激的观点。事实上只要选择合适的固定剂,这种方法是能展示给我们细胞结构的许许多多细节的。当然,另一方面在应用此法时也不应该忘掉它的固有缺点。在研究某种结构时,最好同时多用几种固定剂，对比分析所观察的现象，以免做出主观的判断。活体观察法的优缺点与固定法正好相反。它的优点是能够如实地反映生活细胞的情况。但完全做到这一点也并不容易，必须严格控制实验条件，最大限度地使所观察的细胞得到正常生活条件。活体观察的缺点是，显示细胞结构的精细程度较差。这和在活体情况下细胞内各种结构的折光率相近有关。相差显微镜的运用虽然在一定程度上可以克服这一缺点，但较之固定法在显示细胞结构的精细程度上仍大有逊色。由于组织培养方法的进步，能够进行活体观察的细胞种类也大大增多。固定法和活体观察法各有优缺点，不能互相代替。只有结合并用，取长补短，方有利于全面认识细胞生活的真相。二各种显微镜观察细胞离不开显微镜（Microscope）。这正象观察天体要用望远镜一样。常用的显微镜有普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜等。1、普通光学显微镜（Lightmicroscope）的分辨本领各种显微镜识别微观物象的能力常用分辨力（resolvingpower）的概念来表示。分辨力是指能够区分相近两点的最小距离，能够区分的两点间距离越小，表示显微镜的分辨力越高。分辨力亦称分辨本领。显微镜的分辨力是由物镜决定的。它和物镜的镜口率、照明光线的波长有直接关系。分辨力可按下式计算：0.61λR=--------……………………(a)NAR-------分辨力λ-------照明光源的波长NA------镜口率（数值孔径）SinαNA=n．---------……………………(b)2n-------物镜与标本间的介质的折射率α-------物镜的镜口角所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度（2-1）。镜口角α小于180α，故Sin1/2的最大值也小于1。从公式（a）可以看出，为提高分辨力，光源波长(越小越好，而物镜的镜口率NA越大越好。按可视光线的波长(（400-700毫微米）为540毫微米，物镜的最大镜口率为1.3计算，R=0.25微米。这就是说，相近两点的距离小于0.25微米时，普通光学显微镜将不能分辨出这两点。因为可视光线的波长可小到400毫微米。所以一般认为普通光镜的分辨本领的极限约为0.2微米。细胞中的结构如染色体、线粒体、中心体、核仁等大于0.2微米，在光学显微镜中能观察到。这种结构称显微结构（microscopicstructure）内质网的膜、核膜、微管、微丝等因小于0.2微米，在普通光学显微镜下看不到，称为亚显微结构（submicroscopiestructure）。从公式(b)可以看出，要增大镜口率必须提高物镜与标本间介质的折射率。空气的折射率为1，香柏油的折射率为1.515。因为要增大镜口率必须用油浸物镜。2、暗视野显微镜暗视野显微镜(darkfieldmicroscope)是根据丁达尔(Tyndall)效应的原理设计的。若在暗室中穿入一细束光线,那么由侧面观察时,那些在普通照明的散射光下看不见的空气中的细小尘埃颗粒,可以看得很清楚。这种现象称丁达尔现象。暗视野显微镜是因为视野内不能直接看到照明光线,只能看到被检物体散射或衍射的光线。故视野内呈黑暗状态。由于被检物体表面散射的光亮.才使我们能够在黑暗的视野中观察到被检物体的外形和运动。普通显微镜的最高分辨力如上所述为0.2微米,而暗视显微镜虽然对被检物体的细微构造分辨不清,但却可看到0.004微米以上的微粒子的存在。这是普通光学显微镜所不具有的特性。暗视野显微镜与普通显微镜的构造差别,在于集光器的特殊。普通显微镜换上暗视野集光器或用中心挡光法(用黑色厚纸或金属薄片制成圆形挡光片。放在普通集光器下面的滤光玻片上，挡住中央光束)。即可取得暗视野效果。用中心挡光法若想取得良好的暗视野效果，除了选择适当直径的中心挡光片外，还须考虑反射镜的角度，光源的强度等各种因素。常见的暗视野集光器是抛物面集光器（图2-2）。它的集光镜是一个单透镜，周围成斜度较小的抛物线形式。由显微镜的反光镜反射出的光线，被集光镜的中部遮光板所阻挡，但侧面光线则自由进入遮光板旁和透镜边缘之间的缝隙。这些光线在聚光镜的抛物面的凹面上发生折射,结果光线集中到聚光镜的界面以外,处于观察标本的平面上。由于直线进行的光束被遮光板挡住不能进入物镜,因此视野变暗。而折射光线集中到标本的物镜结构时被散射非常光亮,通过物镜达到观察者眼中,故观察细胞的某些结构(尤其是细胞质颗粒)是亮的(图2-3)。3、相差显微镜人们在显微镜下观察被检标本时,只能靠颜色(光波的波长)和亮度(光波的振幅)的差别看到被检物的结构。活细胞近于无色透明,当光波通过它时颜色和亮度变化不大。因此在普通光学显微镜下细致观察活细胞的结构是很难的。三十年代Zernike.F.提出相差显微镜(phasecontrastmicroscope)的原理和设计,四十年代开始制造相差显微镜出售。由于有了相差显微镜,在一定程度上克服了上述困难可以直接看到活细胞中的结构变化。相差是指同一光线经过折射率不同的介质,其相位发生的差异。那么什么是相位呢？相位是在某一时间上光的波动所能达到的位置。当光波通过两种不同折射率的物质时(如由空气入水,或由空气入玻璃),其波长、振幅和相位皆有不同程度的变化。例如,使光分别通过1公分厚的水和玻璃时,由于水和玻璃的折射率不同,通过它们的光波的相位产生一定差异（通过玻璃的光波的相位落后)。这个相位差异称相差(图2-4)。相差决定于光波所通过的介质的折射率之差与厚度,等于折射率与厚度的乘积之差。介质越厚或折射率越大,光波减速也越大。光线的相差用肉眼分辨不出,只有利用衍射和干涉现象,把相差变为振幅差,即明暗之差,肉眼才能识别。光波通过小颗粒(物体)后产生直射光和衍射光。后者的振幅较小,相位延后(图2-5)。当在光学系统中,这种直射光和衍射光相遇时,根据它们相位的异同,其振幅发生减小或加大的变化,使光线变暗或变亮,这种现象称为干涉。相差显微镜的工作原理如图2-6和图2-7所示。光线通过聚光镜下的环状光阑在物镜的焦点面聚光。载片上的物体A受来自环状光阑的光线照射,直射光在A’处成像，而散发的衍射光一部分也由于物镜透镜的作用在A’成像。这时观察者看到的是直射光和衍射光在A’处干涉形成的像。但如果使用的是普通物镜，衍射光的相位落后1/4波长，并且比直射光的成像弱，因此干涉合成的光与背景光线的振幅差别很小。相差显微镜的物镜中安装有相板。相板有推迟直射光或衍射光的相位和吸收光量，以调节直射光或衍射光的亮度的作用。利用相差物镜的相板，把直射光推迟1/4波长，使直射光和衍射光维持同一相位（图2-7、B）两者的光波由于干涉现象，其振幅为二者之和。因背景只有直射光,故被照射的物体比背景亮,称明反差(brightcontrast)或负反差(negativecontrast)。如用另一种相差物镜的相板,把衍射光推迟1/4波长,直射光的衍射光的相位差变成1/2波长,由它们干涉合成的光波振幅为二者振幅之差(图2-7、C),故被照射物体比背景暗,称暗反差(darkcontrast)或正反差(positivecontrast)。相差显微镜的装置和普通显微镜不同者是前者聚光镜下加环状光阑.物镜里装有相板。另外有调轴望远镜。不同倍数的相差物镜要用相应的环状光阑。因此环状光阑有10×、20×、40×、100×等不同直径的,装配在一个旋转盘内,按需要调换使用。物镜的相板上有一个半透明环,环和环以外的部分涂有不同的物质,使通过的光线产生一定的相位差,以取得明反差或暗反差效果。用显微镜目镜看不清光阑亮圈和相板的环状圈。只有用调轴望远镜方能看清楚,以便转动调节装置,使两个环圈重合对齐。这样才能发挥相差显微镜的效能,看清活细胞的结构。相差显微镜的光源要用强光,并使用波长较短的单色滤光玻璃,通常用绿色玻片。4、荧光显微镜某些物质受紫外线照射时发