细胞生物学实验-本科

细胞生物学实验-本科周次实验名称课时数（共9）8实验一细胞形态的观察及显微镜的使用310实验二线粒体的超活染色与观察312实验三细胞骨架的染色与观察3实验一细胞形态的观察及显微镜的使用一、目的和要求1．练习和巩固使用显微镜的基本方法2．了解细胞的基本形态和结构3．学习生物绘图法二、仪器设备1．普通光学显微镜（每人一台）。2．同学用制片：平滑肌细胞永久制片人精子永久制片猫脊髓横切永久制片卵巢切片永久制片三、实验内容1．平滑肌细胞平滑基细胞切片表本地背景下观察，可以看到许多被染成粉色的平滑肌纤维，平滑肌纤维是梭型的细胞，细胞界限不明显，被染成兰紫色的椭圆形的细胞核位于细胞的中央，找一处切的比较薄而染色均匀的部位换高倍镜仔细观察。注意平滑肌纤维的横切面与纵切面的区别。2．人精子细胞取人精子涂片标本置于低倍镜下进行观察，找出目标后，换用高倍镜观察，可以见到椭圆形的精子细胞的头部和细长的尾部。醋酸洋红染色，头部和尾部均呈粉红色。3．神经细胞取猫脊髓横切制片，先用肉眼观察，分出灰质和白质，而后放在低倍镜下观察，在灰质中有许多被染成棕黄色的多极神经元（HE染色的片子中多级神经元被染成紫红色）。细胞形状各异，细胞核一般为球形，染色较浅，核仁清晰（在HE染色时核染色极淡，和人明显，被染成兰紫色）。低倍镜下观察后换高倍镜仔细观察。4．卵细胞卵巢是产生卵和分泌性激素的器官。卵巢表面覆有单层扁平或立方细胞构成的表皮上皮，上皮下方位致密结缔组织组成的白膜。卵巢分为外周的皮质和中央的髓质，两者界限不明显。髓质狭小，为疏松结缔组织，其中有较多的弹性纤维和较大的血管。皮质较厚，含有不同发育阶段的卵泡，卵泡间富有梭形细胞和网状纤维，胶原纤维较少。卵泡是由卵细胞和围绕卵细胞的卵泡细胞组成。卵泡生长发育过程中，其结构发生一系列变化。一般可分四个时期：①原始卵泡：位于皮质浅部，数量多。由中央一个初级卵母细胞及包围它的单层扁平卵泡细胞组成，初级卵母细胞较大，核大而园，呈空泡状，核仁大而明显。②初级卵泡：有一个位于中央的初级卵母细胞和周围的单层或多层的卵泡细胞组成。初级卵母细胞已经逐渐变大，卵泡细胞表面的基膜明显，在卵泡细胞和初级卵母细胞之间出现一较厚的富含糖蛋白的酸性膜，称为透明带。③次级卵泡：当卵泡细胞增厚至6-12层时，细胞间出现一些腔隙，随着卵泡的发育增大，小腔逐渐合并成一个较大的卵泡腔，腔内充满卵泡液。由于卵泡液增多和卵泡腔的扩大，将初级卵母细胞与周围的一些卵泡细胞挤至卵泡的一侧，形成一个突入卵泡腔的隆起，为卵丘。此时的初级卵母细胞体积更大，紧靠卵细胞的一层卵泡细胞也长大成柱状，并整齐地排列成放射状，称放射冠。这种具有一个大卵泡腔的次级卵泡，又称囊状卵泡。④成熟卵泡：囊状卵泡急需增大，并向卵巢表面突出，为成熟卵泡，成熟卵泡腔大，卵泡细胞停止增殖。四、作业与思考题1、绘出平滑肌细胞、神经细胞的显微图？2、显微镜使用过程中需要注意哪些问题？实验二线粒体的超活染色与观察一、实验目的1.观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。2.学习一些细胞器的超活染色技术。二、实验原理活体染色是指对生活有机体的细胞或组织某些结构能着色但又不影响细胞的生命活动和产生任何物理化学变化以致引起细胞的死亡的一种染色方法。因此活染技术通常可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。三、实验用品（一）材料人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞（二）器材显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。（三）试剂1．Ringer溶液氯化钠0.85g氯化钾0.25g氯化钙0.03g蒸馏水100ml2.1%詹纳斯绿（JanusGreen）B溶液（原液）称取50mg詹纳斯绿B溶于5mlRinger，稍加微热(30～40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。3.詹纳斯绿B溶液（应用液）取1%原液1ml加入49mlRinger溶液,混匀即可。现用现配。四、实验操作1.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察(1)取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴詹纳斯绿B应用染液。(2)实验者用牙签宽头在自己口腔粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10～15min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。(3)在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染或蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。2.洋葱鳞茎表皮细胞线粒中的超活染色观察(1)用吸管吸取詹纳斯绿B应用染液，滴一滴于干净的载破片上，然后撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10～15min。(2)用吸管吸去染液，加—滴Ringer液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。(3)在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据、细胞核被挤至—侧细胞壁处。细观察细胞质中线粒体的形态与分布。五、实验报告及作业绘制口腔上皮细胞、洋葱鳞茎表皮细胞中线粒体的形态与分布。实验三细胞骨架的染色与观察一、实验目的1、掌握考马斯亮蓝R250对细胞骨架染色的方法。2、掌握细胞骨架的制备方法与显微形态观察。二、实验原理细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。三、实验用品(一)材料洋葱（二）器材显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、PH计（三）试剂1.0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)0.2mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液（PB，PH7.3）50ml0.15mol/LNaCl双蒸馏水加至1000ml2.PB0.2mol/LNa2HPO477ml0.2mol/LNaH2PO423ml3.M-缓冲液咪唑(PH6.7)50mmol/LKCl50mmol/LMgC120.5mmol/LEGTA1mmol/LEDTA0.1mmol/L巯基乙醇1mmol/L甘油4mmol/L用1mol/LHCl调pH至7.2。4.1%的TritonX-100/M-缓冲液5.0.2%考马斯亮蓝R250染液甲醇46.5ml冰醋酸7ml蒸馏水46.5ml6.3%戊二醛-PB溶液（PH7.3）四、实验操作取洋葱内皮1cm左右置于含PBS液的载玻片上湿润后，吸去PBS加2滴1%TritonX-100/M-缓冲液，5min吸去缓冲液，加3%戊二醛-PB溶液，固定30min加PBS洗2次，共3min加0.2%考马斯亮蓝R250染色30min用PBS洗2次，共2min，吸干镜检并绘图五、实验建议1.用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理材料时，应控制在30min左右。2.每一次加液或染色后，应用PBS洗2次，并用滤纸吸干。六、实验报告及作业1.画出实验所观察到的细胞骨架图，并注明放大倍数。2.为什么用TritonX-100的缓冲液处理材料？