细胞穿膜肽的研究进展

细胞穿膜肽的研究进展摘要：细胞穿膜肽(CPP)是具有穿透多种细胞膜功能的小分子多肽,能携带生物活性大分子物质进入细胞。由于CPP缺乏组织选择性和靶向性,限制了其在肿瘤治疗领域的应用。近年来发现的一些具有细胞穿透功能的短肽（少于30个氨基酸）即细胞穿膜肽（CPPs）,能够有效地将蛋白质、多肽、核酸片段等以多种方式导入多种哺乳动物细胞,其转导效率高且不会造成细胞损伤。CPPs的发现为生物大分子在细胞生物学、基因治疗、药物体内转运、临床药效评价以及细胞免疫学等研究领域等均具有良好的应用前景。本文就CPPs的种类特点、内化机制、应用及其存在的问题进行讨论和评述。关键词：细胞穿膜肽；靶向性；穿膜机制1细胞穿膜肽的性质、分类到目前为止,已发现了多种CPPs,它们共有的性质:①具有净正电荷性和两亲性；②穿膜转运效率高;③可以导入近乎所有的细胞；④可以携带多种活性物质进入细胞；⑤可以通过固相合成或原核表达制备,方法成熟简便。CPPs的分类以及统一的术语还没有。根据不同的分类标准,得到不同的种类。最近有学者根据短肽的特点和来源将其分为3大类:①蛋白衍生肽(proteinderivedCPPs),如penetratin、TAT和pVEC等；②模型肽(modelpeptides)如MAP和(Arg)7等；③设计肽(designedCPPs)如MPG和Transportan等。从其两亲性性质也可将其分为3类:①两亲性CPPs(PaCPPs),如MPG、transportan、TP10、Pep-1;②中等两亲性CPPs(SaCPPs),如penetratin,RL16；③非两亲性CPPs(NaCPPs),如R9。2细胞穿膜肽的穿膜机制尽管细胞穿膜肽已经成为近年来的研究热点，但其穿膜机制目前仍暂无定论，且存在很大争论因此，弄清细胞穿膜肽的内化机制，是将其作为药物载体应用于临床研究前需要解决的首要问题目前，对于CPPs穿膜机制的描述主要有以下2种。第一，通过胞吞作用进入细胞这方面研究多是通过荧光标记并使用胞吞作用抑制剂的方法，通过对比胞吞作用抑制剂使用与否对CPPs及其底物入胞作用的影响，来评价CPPs的入胞机制。第二，通过静电作用与细胞膜相结合并诱导膜脂质双分子层产生短暂的孔隙而直接渗透进入细胞由于目前所研究的细胞穿膜肽多以阳离子CPPs为主，如HIVTat，寡聚精氨酸等因此，有人提出，细胞穿膜肽的穿膜机制可能与其电荷特性有关，而人体组织细胞表面为负电荷特性，也为阳离子CPPs与之吸附及发生穿透作用提供了理论依据Herce等认为细胞穿膜肽的阳离子特性不仅使CPPs有易于与细胞膜表面的结合，还能够诱导膜双分子层的失稳并产生短暂孔隙Herce等进一步通过实验测定脂质双分子层的电子流向证实了这种假设，并认为精氨酸残基在阳离子CPPs诱导的穿膜作用中扮演重要角色。3细胞穿膜肽的应用近年来，细胞穿膜肽作为分子载体应用于体内外入胞转运的研究越来越多与其他生物大分子转运方法相比，细胞穿膜肽介导的入胞作用具有很多优势首先，细胞穿膜肽能够有效转导具有不同分子量和天然性质的大分子进入细胞；其次，细胞穿膜肽毒性相对较小；再次，细胞穿膜肽的非特异性穿膜作用使其应用更广泛；最后，细胞穿膜肽不仅可以应用于注射给药，还可以用于鼻黏膜给药口服给药细胞穿膜肽可以运输多种物质到哺乳动物的的多种细胞中，包括:小分子核酸，多肽，蛋白，质粒DNA，寡聚核苷酸，脂质体及其他一些纳米药物载体等。这些应用为疾病诊断和治疗提供了一种新方法，大大推进了分子生物学、药学、细胞生物学、疫苗学、甚至影像学的发展。近年CPPs的应用进展如下：3.1蛋白质及多肽类药物的运输对许多疾病使用外源蛋白质或多肽类药物是一个非常有价值的治疗方法。Wu等利用穿膜肽的蛋白转导功能来介导信号肽-绿色荧光蛋白-穿膜肽NT4-GFP-Ant融合蛋白通过细胞膜和血脑屏障到达靶细胞。Tat(Tat48−60)能将细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂的细胞毒素肽模拟物P21EAF1/CIP1运输到细胞核内,且研究发现Tat48−60–P10可以诱导细胞凋亡。Zhang等[1]根据一种α螺旋肽CAI的结构设计出了一种细胞穿膜肽NYAD-1,它比CAI具有更稳定的α螺旋结构,研究发现,NYAD-1能够穿过细胞膜并与Gag聚蛋白共定位于质膜上,破坏病毒颗粒的自组装。研究者[2]设计了一种含有穿膜肽、弹性蛋白类似多肽ELP(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)和一种衍生于细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂P21的结合多肽,这种多肽能够使SKOV-3卵巢癌细胞和HeLa子宫癌细胞的生长速率减慢而抑制它们的增殖。HIV-Tat与小泰勒虫抗原Tp2结合形成重组Tat-Tp2融合蛋白,发现其能够加强迟钝的CD8+T细胞反应的兴奋性。3.2核酸类药物的运输核酸类药物的细胞运输具有挑战性。最近有关使用CPPs进行核酸细胞运输的例子较多。研究证明,细胞膜穿透性寡肽——八聚精氨酸(R8)修饰的脂质体可以有效输送siRNA进入细胞并增强其生物学功能。Palm-Apergi等[3]研究一种细胞穿膜肽MAP,用这种典型的抗菌肽处理细菌产生细菌空壳,这种空可以载入所需的DNA或质粒并将其运输进入哺乳动物细胞内,还可以用于预防接种。Meade等[4]研究认为,CPPs为双链siRNA进行细胞内化去诱导RNAi反应提供了一种好方法。Veldhoen等[34]研究发现一种新的载体肽MPGα能同时与核酸形成非共价连接的、具有高灵活性的复合物,它可以作为运输siRNA的载体。与转座子结合的“睡美人”转座酶能将特殊基因转移进目标动物体内。这些特殊基因有助于治疗多种疾病。有研究[5]发现细胞穿膜肽M918可以完成“睡美人”转座酶和一个外源转座子质粒(带有一种抗生素基因)在体外的细胞内共转导运输。具有空间位阻的带电荷中性寡核苷酸类似物,如肽核酸(PNA)和磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO),在反义引物的应用方面具有很好的生物学和药理学性质。然而,寡聚核酸在细胞内不能自由运输,因此,Lebleu等[6]研究了两种富含精氨酸的CPPs(R-Ahx-R)4AhxB(R=精氨酸,Ahx=胺己苯酸酯,B=β-丙氨酸)和R6Pen,它们能够在胞内体溶解剂存在的情况下,在低摩尔浓度下将PNA和PMO进行有效的核运输。研究发现,固相合成穿膜肽Tat能够携带质粒DNA穿过细胞膜进行基因转染,并对细胞活性无明显影响[7]。3.3小分子药物运输研究表明,富含精氨酸的细胞穿膜肽可以直接运输磷酸二酰胺吗啉齐聚物进入鼠类白细胞,抑制其基因表达和改变前体mRNA的剪接[8]。Lindgren等[43]设计了一种CPP与细胞抑制剂甲氨蝶呤(MTX)的结合物,用于克服乳腺癌肿瘤细胞对甲氨蝶呤的耐受。将2',5'-寡腺甙酸四聚物(2-5A)与短链HIV-1Tat肽用化学方法结合产生2-5A-Tat嵌合体[9],此嵌合体可以被细胞吸收并能在完整的细胞中活化核糖核酸酶L,它可能为HIV的RNA在体内的靶向破坏提供了一种方法。3.3增强药物的吸收及其他特殊功能Kamei等[10]发现通过使用CPPs可以促进胰岛素的肠内吸收。Khafagy等[11]研究发现L-型穿膜肽penetratin可以显著增加胰岛素的渗透性而使其穿过鼻膜,并对鼻吸收黏膜上的细胞完整性不会引起明显的破坏。Tunnemann等[12]研究认为细胞穿膜肽介导的肽转导作用不仅是一种对细胞内Ca2+无副作用情况下可以增加心肌功能的唯一方法,而且是一般细胞或干细胞中蛋白质之间相互作用的调节和控制的非常有用的工具。Kloss等[13]研究发现,含有4～10个精氨酸残基的寡聚精氨酸,特别是(Arg)8能够抑制细胞内主要的蛋白水解系统。当考虑寡聚精氨酸作为药物的细胞内运输载体时,必须考虑其对蛋白酶的制活性问题。有研究报道,成功设计的一种新的穿膜肽Pep-1-K(衍生于穿膜肽Pep-1)具有强的抗菌活性,可以作为细菌选择性抗菌肽[14]。Johansson等50研究发现了一种含有22个氨基酸残基的衍生于肿瘤抑制基因P14ARF的N端部分的肽ARF(1-22),它是一种具有P14ARF功能的类似物,对细胞膜有穿透性,膜破坏性低且能诱导细胞凋亡。以前研究认为大多数CPPs可以易位穿过哺乳动物细胞质膜,而不能穿过像酵母细胞的细胞膜。然而,Parenteau等[15]对20种CPPs进行了测试,发现有一种肽Tp10能有效的穿过裂殖酵母细胞并在细胞内均匀分布。由于治疗分子不能穿过质膜,基因和药物运输进入眼部组织,例如视网膜和角膜被阻碍,Johnson等[16]研究发现了一种能用于眼部组织运输的新肽POD,能够运输小分子和大分子药物进入神经视网膜色素上皮细胞和角膜细胞等。如果能够通过高分辨率成像技术追踪干细胞的分布和分化的能力,对临床和研究非常重要。Liu等[17]用一种典型的CPP承载钆颗粒,此颗粒可以用于骨髓间质干细胞的磁共振成像。荧光成像技术确定此复合物可以内化进入干细胞质和核内,毒性实验和流式细胞仪分析表示此复合物不会影响细胞的生存和膜电势梯度。关于CPPs的氨基酸序列见表1。表1CPPs的氨基酸序列4细胞穿膜肽在应用中的不足CPP缺乏组织选择性和肿瘤靶向性,单纯凭借CPP无法使抗肿瘤药物定向积,使作用于肿瘤部位的药物浓度减少,对正常组织的损伤性增大。同时CPP的正电性易与血浆中荷负电的成分发生相互作用,从而被网状内皮系统快速清除,导致CPP在体内不稳定,极大地限制了其在肿瘤治疗中的应用[18]。因此,提高CPP的肿瘤靶向性是将其应用于肿瘤治疗领域的关键。CPPs在药物运输过程中的使用存在的另外一个弊端是其稳定性差。CPPs内化后,由于体内含有各种蛋白酶,它可能会酶解外源CPPs及其药物分子；体内的环境包括pH值、离子浓度等都有可能改变CPPs的某些性质使其失去活性。因此,必须通过寻找新的稳定的CPPs[58]或对现有的CPPs进行修饰改进来解决这方面的问题。一些蛋白在内化进入细胞后不再具有生物活性,可以考虑在蛋白和CPPs之间插入一个连接分子来辅助在细胞内释放有活性的蛋白和药物。此外,CPPs是否有免疫原性或半免疫原性及长期应用会对机体产生何种影响,需要将CPPs序列进一步的优化以提高其适用性[19]。一些证据显示,CPPs可以与任意的分子结合,非靶向性进入细胞内,导致生物活性药物不必要的损失。因此,如果不能建立可行性使用方法以促进细胞特异性运输,将限制细胞穿膜肽在机体内运输药物等方面的应用。目前,在能够有效利用CPPs运输药物以充分发挥治疗作用方面有价值的应用实验结果还鲜见报道。这种载药方式在应用中是否存在潜在的细胞毒性以及运输过程中缺乏细胞特异性等问题尚未引起足够的的重视[20]。一些CPPs存在细胞内化差,出现细胞内代谢性降解及一些不良的生物效应如毒性和免疫原性等。需要进一步开展对CPPs的药代动力学、体内分布等相关研究。5展望CPPs的发现为生物大分子用于疾病治疗带来了曙光,在细胞生物学、基因治疗、药物体内转运、评价及细胞免疫学等研究领域均具有良好的应用前景。随着研究深入，越来越多的CPPs及其类似物将被发现和构建，而作为研究基础的对CPPs的基本序列及穿膜机制的探讨尤显重要，特别是新的研究方法和研究手段的建立与验证ACPPs作为一种新型载体应用于靶向制剂，能够显著提高药物的生物利用度，将逐渐成为CPPs领域的研究热点笔者认为，随着研究的深入，构建能够被病变部位或细胞特异性识别并打开的连接键，或进一步提高CPPs融合多肽对靶组织微环境的敏感性。参考文献：［1］ZAROJL,SHENWC.Quantitativecomparisonofmembranetransductionandendocytosisofoligopeptides［J］.BiochemBiophyResComm,2013,307(2):241-247.［2］WENDERPA,ROTHBARDJB,JESSOPTC,etal.Oligocarbamatemoleculartransporters:Des