细胞筛选一嘌呤霉素

细胞筛选一嘌呤霉素(一)确定最优筛选浓度当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×105个/ml的细胞悬液。3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。）4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0,2,4,6,8,10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。）5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天(即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大概需3到14天。在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。(二)转染细胞1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。将已经制备的病毒颗粒0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，有时候Polybrene对细胞有毒性。这时，可以用ProtamineSulfate代替Polybrene）(三)筛选细胞1.病毒感染后24小时，可以换用含最优浓度puromycin的培养基。2.如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至4-6小时，然后换用新鲜培养基，24-48小时后换加含最优浓度puromycin的培养基。最好设立一个对照皿，不加病毒液，加入Ploybrene，观察Polybrene是否对细胞有毒性；如果Polybrene没有毒性，还可以加入puromycin，作为puromycin是否有效的对照。3.以后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细胞的培养基。直到抗性群落能被识别出（一般是在筛选后10到12天）。4.待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm平皿内。5.60mm平皿内细胞长满后，收获细胞，在蛋白或mRNA水平鉴定基因敲低效率。6.10cm培养皿内的细胞待长满后传代，首先每种稳定细胞系冻存4-5支细胞，待基因敲低鉴定清楚后，解冻冻存细胞，进行表型观察分析。通常情况下，由于慢病毒为复制缺陷型病毒，受感染的细胞不能产生新的病毒，因此从加入病毒颗粒开始，经过5-6次换液后，培养基内已不存在病毒颗粒，可以移至普通细胞培养室内培养研究。二G418(一)确定最优筛选浓度由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。1.G418的配制：取1gG418溶于1ml1mol/L的HEPES液，加蒸馏水定容至10ml（使G418终浓度为0.1g/ml,HEPES终浓度为100mmol/L），过滤消毒，4度保存。HEPES的化学全称为羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanicacid），分子量238.31，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间的控制溶液的pH处于恒定的范围，而对细胞无毒性作用。1mol/LHEPES的简单配置：HEPES23．83g，溶解于80ml的双蒸水中，用10mol/L的NaOH调节pH至7.2-7.4，定容至100ml，0.22um小滤器过滤。HEPES使用终浓度为10-50mmol/L。2.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内按0ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml，500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml，900ug/ml、1000ug/ml浓度用无抗无血清培养基稀释G418制成筛选培养基。心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200ug/ml。这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。3.培养待转染（而不是转染后）的细胞。（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）4.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1×104个/ml的细胞悬液。5.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1×103个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养。（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。）汇合度：实际上就是指细胞占培养表面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%汇合，也就是汇合度100%。汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%！6.培养6小时左右开始加药。加筛选培养基筛选:吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基适量。7.换液：每日检查细胞活力，根据细胞活力和培养基的颜色，每三天(即每隔两天)更换筛选培养基一次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。有死细胞勤换液，可以减少对存活细胞的影响。8.确定最佳筛选浓度：在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度。(二)转染细胞1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene，终浓度为8μg/ml。将已经制备的病毒颗粒0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，有时候Polybrene对细胞有毒性。这时，可以用ProtamineSulfate代替Polybrene）3.转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近70％汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时开始筛选。(三)筛选细胞1.加G418：去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基（无抗无血清）(实际应用时可以比最佳筛选浓度高一级别)。2.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药用完全培养基培养。3.待其逐渐增大后，挑出单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。4.单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。