诊断用酶的研究进展

诊断用酶的研究进展2010-03-0708:55:39来源:作者:【大中小】浏览:22次评论:0条酶试剂方法中决定试剂质量的关键是工具酶的质量，而工具酶的生产工艺又是决定其质量和产率的关键因素，因而国内外学者付出了辛勤的劳动，力求选育高产菌株(包括构建基因工程菌)，探索最优化的发酵工艺和后提取纯化技术，以提高酶的产率，保证原酶质量。工具酶的发酵生产和纯化技术涉及微生物工程、酶工程和分子生物学工程领域的专门知识和技术经验，需精密仪器设备，具技术垄断的特点，技术难度相当大。为便于诊断用酶研究生产和临床化学工作者了解医学检验诊断试剂中工具酶的研究现状和进展，现将近10年来有关技术资料作一综述，以供参考。1诊断试剂新工具酶的菌种选育和生产工艺研究十分活跃诊断试剂工具酶的研制是酶制剂工业中的一个小的属枝，同工业用酶相比较，其对底物的专一性更严格，纯度要求高，但用量有限，不易形成很大的生产规模。可喜的是，近10年来一些技术条件较优越的科研院所，很重视这一领域的开创性研究工作，有十几种医学检验中急需的工具酶已经培育出产酶菌株，掌握了发酵制备及酶提纯工艺，并对酶的理化性质作了必要的研究，为解决这些工具酶的国产化生产产提供了技术保证。表1列举了近10年来报道的若干项重要诊断试剂工具酶研究的国内外文献资料，并对这些酶的菌种来源、分布特点、主要用途、工艺技术完善程度及主要技术创新等进行简要的述评。表1近10年来国内外研制成的诊断试剂工具酶工具酶名称来源分布主要应用价值工艺技术完善程度及主要创新特点文献来源脲酶普通变形杆菌胞内血清尿素测定试剂盒经30L发酵罐放大培养，优化发酵条件［1］脲酶芽胞杆菌胞内血清尿素测定试剂盒经摇瓶发酵培养用尿素诱导提高产率［2］脂酶皱落假丝酵母胞外血清TG测定试剂盒(对TG水解完全)经摇瓶培养，使用疏水层析技术分离［3］葡萄糖氧化酶点青霉AS.3.3871胞外血葡萄糖测定试剂盒经38L发酵罐放大培养，使用超滤技术等［4］已糖激酶面包酵母胞内肌酸激酶测定试剂盒使用细胞溶涨、冻溶超声粉碎技术［5］胆红素氧化酶疣疱漆斑菌胞外血清胆红素测定试剂盒优化发酵条件，100ml摇瓶培养［6］胆红素氧化酶疣疱漆斑菌胞外血清胆红素测定试剂盒摇瓶培养，菌种经紫外线诱变，提高产率［7］谷氨酸脱氢酶天津短棒菌T6-13胞内血清尿素测定连续检测法试剂盒对菌种进行诱变处理及摇瓶培养［8］脂肪酶猪胰胞内血清TG测定试剂盒酶理化性质及应用研究较为深入［9］乳酸氧化酶粪链球菌胞内乳酸测定试剂盒加入Tritonx-100破壁效果好［10］胆固醇酯酶假单孢菌胞血清胆固醇测定试剂使用超滤分离技术等［11］外盒胆固醇氧化酶节杆菌82菌株胞外血清胆固醇测定试剂盒产酶条件及后提纯工艺优化［12］L-谷氨酸氧化酶放线菌P-26胞外血清rGT测定试剂盒优化产酶条件［13］谷氨酸脱氢酶猪肝胞内血清尿素测定试剂盒纯化工艺及酶稳定性研究［14］甘油激酶嗜热脂肪芽孢杆菌胞内定量检测甘油试剂盒应用SIPI-Ⅱ蓝色染料配基层析等分离技术［15］α-磷酸甘油脱氢酶兔肌胞内血清甘油三酯酶偶联试剂盒建立了液-液双水相提取新技术等［16］甘油氧化酶日本曲霉AT008胞内血清TG测定试剂盒发酵罐放大培养［17］甘油氧化酶青霉Ts-622胞外血清TG测定试剂盒麦麸固体培养［18］甘油磷酸氧化酶气球菌属变异株血清TG测定试剂盒优化培养条件［19］胆固醇氧化酶红球菌属胞外血清胆固醇测定试剂盒优化培养和分离条件［20］肌酸酶基因来自黄杆菌sup-188肌酸、肌酐测定试剂盒构建成基因工程菌并完成基因表达［21］肌酸酐酶基因来自假单孢菌属sp.ps-7肌酐测定试剂盒构建成基因工程菌并进行表达［22］分析上述文献资料，对当前诊断试剂工具酶研究发展趋势可以得出以下几点印象：1.1通过诱变技术和底物诱导作用等方法，选育出稳定、高产的优良菌株是决定微生物发酵工程成败的关键所在。这对常规发酵生产或进行基因工程菌的构建都是如此。而培育出一种价值很高的目的菌株，是一种能够产生高效益的重大科技创新，应给予重视和支持。1.2寻找产生胞外酶的菌种，能为酶的提取纯化(下游工程)提供极大的便利。因为胞内酶分离中遇到大量菌体蛋白的干扰，使分离纯化程序复杂化，加大了目的酶的损失。而胞外酶无需破碎细菌细胞，培养液中杂蛋白量少，可用较为简捷的分离纯化方法加以提纯。1.3对传统的酶分离纯化工艺进行改进，采用温和、高效的生化新技术，如超滤技术、疏水层析技术等，能够显著提高目的酶的纯度和产率。1.4深化酶理化特性的研究，为诊断试剂配制中正确使用工具酶提供科学依据，是当前研究中一项紧迫的任务(后详)。1.5开辟工具酶的新用途，建立新的临床化学酶分析方法，以代替准确性和精密度均较差的化学方法，是一项很有意义的技术创新。当前已有许多新的工具酶问世，如丙酮酸氧化酶、谷氨酸氧化酶、肌酸酐酶、肌酸酶等均有商品酶供应，提供了建立ALT、AST、肌酐等测定新方法技术的工具酶。在这些方面是有大量工作可作的。1.6构建诊断试剂工具酶基因工程菌的工作为我们扩展了一个新的研究领域。基因工程菌能够大大提高目的酶的产量(如日本学者构建的肌酸酶基因工程菌肌酸酶占该菌体内的可溶性蛋白的20％以上)，将给工具酶的生产带来革命性的变革。这项工作在国内起步较晚，目前尚未见到成果问世。2诊断试剂工具酶理化性质的研究相对滞后掌握工具酶的理化特性参数对研制和正确使用酶法诊断试剂有指导意义。这些参数包括酶分子量、等电点、Km、最适pH和酸碱耐受范围、最适温度和热稳定性、底物特异性、抑制剂、激活剂和保护剂的种类、剂量等，在新酶研制过程中都应该作出更深入的研究，测出准确的数据。然而，表1所列举的22篇新工具酶研究论文中，对所研究的新工具酶作了Km值测定的仅有5篇；用两种方法同时测定一种酶分子量的仅1篇，用一种方法测定酶分子量的也只有5篇；只有9篇测了最适pH和最适温度；有6篇作了底物特异性实验；观察了抑制剂的也只有4篇。这似可提示，当前工具酶研究领域里，对新酶理化特性的研究上存在滞后情况，应予以重视。而工具酶的主要理化特性，因菌种来源不同是有差别的。如胆固醇氧化酶，来自链霉菌的分子量为34000，而来自短棒杆菌属的分子量为60000；Km虽然是酶特征性常数，但其数值受缓冲液不同离子种类和强度的影响较大。因而在报告时应详细说明测定条件，这样才便于相互比较。为便于临床化学实验室了解常用工具酶的理化特性，本文从某些专著及生产厂家的产品证书中编录了十几种常用工具酶的主要理化特性参数(见表2)，有一定的参考价值。表2常用工具酶的理化特性及质量要求名称来源分子量等电点(pH)配制酶试剂所需的比活性(U.mg－1)杂酶及其活性占工具酶活性的％(允许限度)葡萄糖氧化酶(GOT)A.nigenP.notatum1860001520004.30＞20蔗糖酶含量应＜0.01％过氧化氢酶应＜10U*mg－1蛋白已糖激酶(HK)酵母1050004.50～4.80＞140磷酸葡萄糖异构酶应＜0.01％；G-6-P脱氢酶应＜0.01％苹果酸脱氢酶(MDH)心肌700006.1～6.4AST相对于MDH应＜0.005％；GLDH相对于MDH应＜0.003％葡萄糖－6－磷酸脱氢酶(G-6-PDH)酵母2120004.50＞140己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶应＜0.02％过氧化物酶(POD)辣根402007.20＞50不含胺氧化酶及过氧化氢酶天冬氨酸酶≤0.02％脲酶巨豆4830004.905-100精氨酸酶≤0.002％铵离子≤0.0005μg*U－1谷氨酸脱氢酶(GLDH)变形杆菌3000004.60醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶应＜0.01％乳酸脱氢酶(LDH)心1350004.5～4.8≥500丙氨酸转氨酶＜0.005％GLDH＜0.005％；丙酮酸激酶、醛缩酶＜0.001％脂蛋白脂酶(LPL)心假单胞菌属50394(人)470005.9±0.05＞100128ATP酶＜0.00008％，CHOD＜0.002％，NADH氧化酶＜0.001％，POD＜0.02％甘油激酶(GK)嗜热脂肪芽胞杆菌20900≥85NADH氧化酶＜0.01％，己糖激酶＜0.02％磷酸3-甘油氧化酶足球菌760004.6±0.1＞40乳酸氧化酶≤0.001％胆固醇脂酶(CEH)假单胞菌302000＞25NADH氧化酶＜0.001％，过氧化氢酶＜1U*mg-1，尿酸酶＜0.00004％，ATP酶＜0.00008％，GOD＜0.00001％胆固醇氧化酶(CHOD)链霉菌340005.1～5.4＞25CEH＜0.005％，GOD＜0.00014％，NADH氧化酶＜0.0007％，尿酸酶＜0.0004％胆红素氧化酶(BOD)疣胞漆斑菌520004.10＞0.2尿酸酶肝1000006.3≥15过氧化氢酶＜1.0％丙酮酸氧化酶2600004.30≥1.5ATP酶≤0.05％，ALT、AST≤0.05％3常用工具酶的实用性质量标准尚未确立评价临床化学酶法试剂的质量，离不开对工具酶的质量评价。从实用角度考虑，一个好的工具酶应当具备的基本条件是：①对底物专一性高；②热稳定性好；③酸碱耐受范围较宽；④比活性高；⑤有害杂酶含量在一定限度以内。前三项指标已包含在酶的理化特性之中，下面对比活性和杂酶含量问题作进一步的讨论。3.1酶的比活性：酶的比活性是评价酶纯度的最好指标。即每毫克(酶)蛋白所具有的酶活性(U.mg－1)。酶的比活性越高，表明酶的纯度越高。酶的比活性高低决定于酶纯化工艺的有效性。诊断试剂盒用工具酶要求有适当的比活性即可，不必要求越高越好。3.2杂酶含量：为兼顾降低工具酶的生产成本和保证酶试剂的质量，对工具酶中容易引起有害反应的一些酶(即所谓杂酶)的含量提出了“允许限度”(见表2)。这些要求有些录自有关临床化学专著，有些摘自生产厂家的产品鉴定证书。目前尚未见到国家卫生部的推荐标准。基金项目：全年九五医学科研基金资助项目(98M017)作者简介：罗侃(1936?，男，教授［1］倪星忠，黄晓，黄乙雪，等．从普通变形杆菌生产脲酶的研究［J］．生物工程学报，1989，5(2)：135－139．［2］谢新东，陈济琛，林新坚，等．一株芽孢杆菌产生脲酶条件及脲酶提取研究［J］．微生物学通报，1996，23(2)：81－84．［3］吴国平，徐景娣，卞祖宁，等．皱落假丝酵母脂酶发酵及纯化工艺研究［J］．中国医药工业杂志，1990，21(4)：145－149．［4］罗侃，崔有宏．葡萄糖氧化酶与血糖试剂盒的研制［J］．甘肃科学学报，1992，4(1)：52－56．［5］田清超，计学才，刘筱初．面包酵母中己糖激酶的研制［J］．工业微生物，1991，3：1－5．［6］郭健，陶沙，莫培生．胆红素氧化酶产酶菌株的分离及最佳产酶条件的研究［J］．微生物学报，1991，31(2)：156－159．［7］胡军，杨军艳，张继宏．胆红素氧化酶产生菌的选育及发酵工艺条件的研究［J］．食品与发酵工业，1997，23(2)：22－25，31．［8］张克旭，刘永生．天津短杆菌T6-13谷氨酸脱氢酶的研究［J］．微生物学报，1991，31(4)：281－286．［9］陈菊娣，柴淑兰．从猪胰制备甘油三酯测定用脂肪酶［J］．中国医药工业杂志，1993，24(1)：1－3．［10］陈统明，杨光礼，秦克亮，等．乳酸脱氢酶分离纯化的研究［J］．中国医药工业杂志，1992，23(6)：241－243．［11］杨光礼，陈壁佩，张一闵，等．假单胞菌胆固醇酯酶的生产Ⅰ和Ⅱ［J］．医药工业，1987，18(3)：112－115，18(11)：486－488．［12］苏超恒，法幼华．节杆菌82菌株胆固醇氧化酶的产生条件［J］．微生物学报，1991，31(6)：449－453．［13］徐水清，李友荣．L－谷氨酸氧化酶产生菌的筛选与产酶条件［J］．微生物学报，1993，33(4)：309－312．［14］刘兰英，张应现，杨平，等．谷氨酸脱氢酶的制备工艺及稳定性研究［J］．中国医药工业杂志，1993，24(9)：38