大学生创新项目开题报告

上海海洋大学水产与生命学院2011年上海市大学生创新项目计划实验开题报告题目斑马鱼尾垂体血管网形成过程的研究负责人姓名梅桂华学号0913214专业生物科学(海洋生物)指导教师吕为群职称博士生导师2012年2月22日2说明1、大学生创新实验（设计）工作开始之前，项目组学生需认真填写上海海洋大学水产与生命学院大学生创新项目计划实验开题报告。开题报告重在反映各项目小组的资料准备情况以及详细的实验准备情况。2、学生要认真填写创新实验（设计）工作准备的进展情况，指导教师要定期检查学生的创新实验（设计）的进展情况。3、本开题报告的各部分内容要完整，校、院、系的工作检查将以此作为主要依据。4、本开题报告填写完整后，一式两份，一份交给指导教师，一份交给学院相关负责老师，作为创新实验阶段性考核的主要依据材料。32011年上海市大学生创新项目计划实验开题报告1、实验（设计）的背景及意义：尾部神经分泌系统(CaudalNcurosccrctorySystem，CNSS)是鱼类所特有的一个神经分泌系统，位于脊髓末端，由行使神经分泌功能的尾部神经分泌细胞(Dahlgren细胞)，Dahlgren细胞发出的轴突以及神经血管器官(尾垂体)组成。在真骨鱼类中，Dahlgren细胞的分泌物---尾紧张素I、II（UI、UII）、促肾上腺皮质激素释放因子（CRH）(Luetal.，2004;2006)和甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)(Ingletonetal.,2002)都转送至尾垂体中进行存储，再由此直接分泌进入尾静脉（Arnold-Reedetal.,1991；Winteretal.,2000；McCrohanetal.,2007）以确保其迅速抵达靶器官－肾、肠、性腺和肝脏(HazonandBalment,1998)来发挥调节作用。尾部神经分泌系统在鱼类的渗透压调节、营养代谢以及应激调控等方面发挥重要的作用。尾垂体是尾部脊髓末端的一个神经内分泌结构，是尾部神经分泌系统的重要组成部分，它是由毛细血管网形成的一膨大的神经血管复合体。目前对尾垂体发生发育的研究较少。有关三文鱼(ChumSalmon)研究表明：三文鱼幼体发育3个月会出现一定形状的尾垂体，其中含有被毛细血管包裹的纤维束。在孵化5个月之后，出现典型的尾垂体(Okaetal.,1993;2000)。罗非鱼孵化近8天时出现尾垂体结构，此神经血液器官位于的脊髓末端腹部膨大区域，内部充满血管(Cionietal.,2000)。而有关尾垂体血管网形成过程及其变化还不完全清楚，有待进一步研究。斑马鱼(Brachydaniorerio)，是一种小型热带鱼。作为一种新型的脊椎模式生物，具有性成熟周期短、繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明等诸多优点。因此，斑马鱼是研究脊椎动物发育的理想模型。转基因斑马鱼(flk1:EGFP)是将增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)标记插入到flk1基因的启动子序列中,获得在血管内皮细胞表面表达EGFP的转基因斑马鱼,因此可以直接在荧光显微镜下观察血管发育情况（丁丽丽etal.,2010）。研究还发现斑马鱼尾部神经分泌系统主要分泌产物UⅡ存在两种类型UIIα和UIIβ（Tostivintetal.,2006)。Parmentier等（2008）报道UIIα和UIIβ只特异性地在尾部神经分泌系统中进行表达。本项目以转基因斑马鱼(flk1:EGFP)为实验对象，通过对尾垂体血管网的形成过程进行研究以确定斑马鱼尾垂体血管网的形成时间和形态变化，并将UⅡ作为一个标志基因用来研究UⅡ在尾垂体中的出现与尾垂体血管网形成过程之间的关系，可为进一步研究尾垂体以及尾部神经分泌系统奠定坚实基础。42、实验（设计）的研究目标：本项目以转基因斑马鱼(flk1:EGFP)为实验对象，通过形态观察、组织切片以及免疫组化等实验方法，研究斑马鱼尾垂体血管网的形成过程，以确定斑马鱼尾垂体血管网的形成时间和形态变化，并将UⅡ作为一个标志基因用来研究UⅡ在尾垂体中的出现与尾垂体血管网形成过程之间的关系。3、实验（设计）的主要研究内容、研究方法、具体措施和研究的可行性、创新点：研究内容：1.通过荧光显微镜观察转基因斑马鱼(flk1:EGFP)的血管生成情况。2．采用组织切片技术对尾垂体血管网进行细致地研究，确定尾垂体血管网的形成时间和形态变化。3．利用免疫组化技术研究UⅡ在尾垂体中的出现与尾垂体血管网形成过程之间的关系。方法:1.收集转基因斑马鱼（Fli1:EGFP）胚胎，培养在含色素抑制剂PTU的胚胎水中，以防止黑色素细胞形成。2.每天定时用荧光显微镜观察转基因斑马鱼（Fli1:EGFP）血管生成情况并照相，记录其形成时间和形态变化。使用MS-222麻醉剂对斑马鱼进行麻醉10分钟，之后用荧光显微镜绿色荧光对转基因斑马鱼（Fli1:EGFP）血管生成情况进行连续的观察。3．采用组织切片技术对尾垂体血管网进行地研究以确定尾垂体血管网的形成时间和形态变化。收集斑马鱼样品制成切片，用荧光显微镜进行观察。并参照Habeck等(2002)的方法，利用定量碱性磷酸酶(endogenousalkalinephosphatase,EAP)染色，对样品进行血管分析(Parngetal.,2002)，所用染色液为NBT和BCIP，染色完成后在立体显微镜下观察，采集图像并拍照，记录尾垂体血管网的形成时间和形态变化。4.通过免疫组化技术研究UⅡ在尾垂体中的出现与尾垂体血管网形成过程之间的关系。收集斑马鱼样品并制成切片，再用UII的特异性抗体进行标记，最后用显微镜进行观察并拍照，用来研究UⅡ在尾垂体中的出现与尾垂体血管网形成过程之间的关系。可行性：实验室已建有斑马鱼养殖系统，实验材料有保证；而且实验室具有斑马鱼孵化槽，可以5进行正常的交配，繁殖活动；项目中所运用到的仪器在本实验室和中心实验室中都已具备，如恒温培养箱，荧光显微镜，普通显微镜，包埋机与切片机烘片机；并且形态观察、组织切片以及免疫组化等实验方法都较为成熟，研究技术手段完全可行，可保证该项目的顺利进行。创新点：本项目首次利用Fli1:EGFP转基因斑马鱼可以实时观测尾垂体血管网的生成，再采用组织切片技术对尾垂体血管网进行地研究，可以确定尾垂体血管网的形成时间和形态变化，最后利用免疫组化技术研究UⅡ在尾垂体中的出现与尾垂体血管网形成过程之间的关系，可为进一步研究尾垂体以及尾部神经分泌系统奠定基础。4、主要参考资料及使用的原始资料（或数据）：[1]Arnold-Reed,D.E.,R.Balment,etal.(1991).ThecaudalneurosecretoryofPlatichthysflesus:generalmorphologyandresponsestoalteredsalinity.CompBiochemPhysiol99A:137-143.[2]Cioni,C.,N.Francia,etal.(2000).DevelopmentofthecaudalneurosecretorysystemoftheniletilapiaOreochromisniloticus:animmunohistochemicalandelectronmicroscopicstudy.JMorphol243(2):209-218.[3]Hazon,N.,andBalment,R.J.(1998).Endocrinology.InThephysiologyoffishes.EditedbyD.H.Evans.2ndedition.CRCpress,NewYork.pp.441–463.[4]Ingleton,P.M.,L.A.Bendell,etal.(2002).Calcium-sensingreceptorsandparathyroidhormone-relatedproteininthecaudalneurosecretorysystemoftheflounder(Platichthysflesus).JAnat200(5):487-497.[5]Lu,W.etal.(2006).MolecularCharacterizationandExpressionofUrotensinIIanditsReceptorintheFlounder(Platichthysflesus):AHormoneSystemSupportingBodyFluidHomeostasisinEuryhalineFish.Endocrinology147(8):3692-3708.[6]Lu,W.,L.Dow,etal.(2004).Coexpressionofcorticotropin-releasinghormoneandurotensinⅠprecursorgenesinthecaudalneurosecretorysystemoftheeuryhalineflounder(Platichthysflesus):apossiblesharedroleinperipheralregulation.Endocrinology145(12):5786-5797.6[7]McCrohan,C.R.,W.Lu,etal.(2007).Fishcaudalneurosecretorysystem:amodelforthestudyofneuroendocrinesecretion.GenCompEndocrinol153(1-3):243-250.[8]Zhen,H,Y,Xue,Y,C,ZhenYS(1997).InhibitionofangiogenesisisbyantitumorantibioticC1027anditseffectontumormetastasis[J].NatlMedJChina,77:657−660.[9]Oka,S.,A.Chiba,etal.(1993).Developmentofthecaudalneurosecretorysystemofthechumsalmon,Oncorhynchusketa,asrevealedbyimmunohistochemistryforurotensinsIandII.CellTissueRes,272:221-216.[10]Oka,S.,A.Chiba,etal.(2000).OntogeneticDevelopmentoftheCaudalNeurosecretorySystemintheChumSalmon,Oncorhynchusketa,withRegardtoItsUltrastructuralChangesandwithRelationtoNeuropeptideY-immunoreactiveFibers.ZoologSci,17(1):103-109.[11]Parng,C,Seng,W,L,Semino,C,etal.(2002).Zebrafish:apreclinicalmodelfordrugscreening.AssayDrugDevTechnol,1:41−48.[12]Habeck,H,Odenthal,J,Walderich,B,etal.(2002).AnalysisofazebrafishVEGFreceptormutantrevealsspecificdisruptionofangiogenesis.CurrBiol,12:1405−1412.[13]丁丽丽,刘明,张胜华,等.力达霉素通过下调VEGF表达抑制斑马鱼胚胎血管生成药学学报.2010,45(4):456−461.75、实验（设计）的进度安排(按照月份、季度和寒暑假安排实验内容和实验目标)：起止时间开展内容2011.2——2012.5用荧光显微镜观察尾垂体血管网的形成过程并记录尾垂体的形成时间以及形态变化2012.4——2012.5采用组织切片技术对尾垂体血管网形成过程进行研究，确定尾垂体血