第五章阻抗蛋白质非特异性吸附载体微球的制备

第五章阻抗蛋白质非特异性吸附载体微球的制备5.1前言高通量药物筛选已经发展到了如何从日益复杂的筛选中获取有效的活性分子，保证活性分子能满足后续的动物和临床筛选，提高筛选结果的效率和质量。建立合理的高通量筛选模型时，必须考虑如何避免非特异性信号和背景噪声的干扰。特别是在低浓度的靶点分子（多为蛋白质）和较高浓度的干扰性非特异性分子共存的体系中，降低非特异性信号的干扰就显得尤为重要。如果无法解决非特异性的信号，则可能降低检测的精确性，甚至出现假阳性和假阴性的结果，最终影响检测结果的质量。目前，常用信噪比（thesignal-to-Noiseratio，S/N）来评价检测和分析结果的质量[11,64,67]。信噪比，顾名思义，就是特异性信号与非特异性噪声的比值。信噪比越高，说明检测和分析的结果就越可靠。成功实施一项高通量药物筛选的项目，要求使用的各种免疫分析能提供高信噪比。因此，针对特定的具体应用，合理设计和优化载体的表面性质，阻抗蛋白质的非特异性吸附，提高检测的信噪比，也是高通量药物筛选孜孜以求的目标。在目前采用的阻抗蛋白质非特异性吸附的材料中，其中PEG因其特殊的亲水性、链柔顺性和无毒等特性，被广泛用于制备阻抗蛋白质吸附材料[136,148,149]。研究认为空间位阻效应是长链PEG阻抗蛋白质非特异性蛋白吸附的重要原因;水化作用是短链的PEG基团阻抗蛋白质非特异性吸附的重要原因[144,145,297]。PEG阻抗蛋白质非特异性吸附的效果与PEG链的分子量、链长度、链组成和链的接枝密度等有关[297-299]。PEG阻抗蛋白质吸附材料的制备方法可以分为物理吸附或共混、化学接枝法,更高层次为制备响应性聚合物和图案化聚合物[136,300]。物理方法得到的PEG分子链因其与基体材料之间的作用力弱而容易脱落，面临着时效性差和吸附性能差等问题。一般改性方法是在PEG分子链末端引入巯基，或者增加其它的作用力[163]。化学接枝法一共有表面接枝(Graftfrom)和接枝到表面(Graftto)两种方法[150]。两种方法制备的PEG阻抗材料能满足不同的要求。如Brooks等人[299]通过表面引发的原子转移自由基聚合法(atomtransportationradicalpolymerization，ATRP)制备了不同分子量的PEG衍生物，并接枝在聚苯乙烯的粒子上。作者发现接枝密度随着PEG分子量的增大而降低，而PEG悬挂端基的尺寸对聚合物刷的水力学厚度有重要影响。通过ATRP法制备的PEG材料具有很好的阻抗性，随着接枝密度的增大，蛋白质吸附降低。在本文中，我们通过烯丙基聚乙二醇(APEG)与苯乙烯分散共聚制备阻抗蛋白质非特异性吸附的微球。本文的目的包括：(1)制备阻抗蛋白质非特异性吸附的单分散性微球；(2)探讨所制备微球阻抗蛋白质非特异性的性能。5.1实验部分5.1.1试剂与仪器苯乙烯，化学纯(≥98%)，购于广东汕头西陇化工厂。使用前，须将苯乙烯先用5％(wt)的NaOH水溶液洗涤、萃取，以完全脱除阻聚剂，然后减压蒸馏，最后将净化后的苯乙烯密封保存于4℃的冰箱中；2，2′-偶氮二异丁腈(AIBN)，分析纯(≥99%)，购于天津科密欧化学试剂开发中心；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，分析纯，平均分子量约30000，购于成都科龙化工试剂厂；无水乙醇，分析纯(≥99.7%)，购于广东光华化学厂。AIBN、PVP和无水乙醇分别用作自由基引发剂、稳定剂和分散介质。烯丙基聚乙二醇(APEG，分子量为2400)购于华威锐科化工有限公司。牛血清蛋白(BovineSerumAlbumin,BSA，第五组分)，美国Amresco公司产品。所需的仪器包括：SencoS-212型恒速搅拌器上海申顺生物科技有限公司W201恒温水浴锅上海申顺生物科技有限公司85-2型恒温磁力搅拌器上海司乐仪器厂AnkeTDL-40B型离心机上海安亭科学仪器厂WS70-1型红外线快速干燥器上海吴淞五金厂DZF6050真空干燥箱上海精宏实验设备有限公司HZS-H水浴振荡器哈尔滨市东明医疗仪器公司BS124S型万分位电子天平德国，Sartorious公司Leitz-AMR-1000SEM德国，LEITZ公司粒径及zeta电位测定仪（Zetasizer®-HS）英国，马尔文公司5.2.2APEG与苯乙烯分散共聚OnOHOnOHdispersionpolymerization(a)Fig.5-1SchematicdiagramofthepreparedAPEGfunctionalmicrospheresbyAPEGandStdispersioncopolymerizationPSt-APEG微球采用间歇式分散聚合法来制备(Fig.5-1)。首先，将60mL乙醇、0.2gAIBN、0.4gPVP和14g苯乙烯同时加入100mL四口玻璃圆底烧瓶，并使烧瓶浸入恒温水浴中。在250rpm的恒速搅拌下，体系中通入N2(约30min)，然后升温至70℃，反应5h。之后将0.5gAPEG溶解于15mL乙醇/水体系中，恒速滴加至烧瓶中，并将搅拌速度调整为300rpm。APEG滴加控制在2-4h内，聚合反应总时间为12h。反应结束后，将制备的微球先用医用纱布粗过滤，再用乙醇和三重水分别对微球进行洗涤、离心、重分散2-3次。最后把分散好的微球置于60℃的干燥箱中干燥24h。5.2.3无稳定剂的APEG与苯乙烯的分散共聚将60mL乙醇、0.2gAIBN、0.5gAPEG和14g苯乙烯同时加入100mL四口玻璃圆底烧瓶，并使烧瓶浸入恒温水浴中。在250rpm的恒速搅拌下，体系中通入N2(约30min)，然后升温至70℃，反应12h。反应结束后，将制备的微球先用医用纱布粗过滤，再用乙醇和三重水分别对微球进行洗涤、离心、重分散2-3次。最后把分散好的微球置于60℃的干燥箱中干燥24h。5.2.4粒径及粒径分布测试取小量待测微球，分散在磷酸缓冲溶液中(pH8.0，0.1M)，保持相同的浓度(2mg/mL)，在Nano-ZS纳米粒度与电位分析仪上测定粒径及分布情况。5.2.5SEM将样品在真空干燥箱中充分干燥，喷金，采用Leitz-AMR-1000的扫描电镜(SEM)观察微球表观形貌。5.2.6蛋白质吸附BSA在微球上的吸附实验是在25℃的恒温水浴中进行的。首先在数只干净的塑料管中分别移入封闭处理后的微球悬浮液(微球含量为50mg)、不同量的BSA(0.36－3.96g)溶液，然后用磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.1M，pH7.0)将溶液体积调整到5.0mL。在每个试管中加入磁力转子，对样品溶液进行温和地磁力搅拌，微球在25℃的环境温度中与BSA共同孵化8.0h。之后，对不同离心试管中的溶液进行离心分离，收集上清液，并用2mL的缓冲溶液再对固相微球洗涤、离心、分离、再分散，重复上述步骤2次。最后收集所有的上清液，并对上清液中BSA的浓度用紫外吸光度法进行测定。微球对BSA的固载量可根据BSA的质量平衡来计算。5.3结果与讨论5.3.1APEG与苯乙烯分散共聚5.3.1.1APEG含量在稳定剂、引发剂浓度和乙醇/水比例相同的情况，考察了功能单体APEG含量对微球性质的影响，结果如Fig.5-2和Fig.5-3。Fig.5-2给出了制备的微球的SEM图片，Fig.5-3是DLS测试微球的粒径和粒径分布。从Fig.5-2可以知道，调整APEG的加入量，所制备微球的单分散性并不太好。但从图片中也可以看出，制备的微球基本上还是呈现球形，没有缺陷，表面很光滑。增大APEG的加入量，出现了更多的小粒子，将使微球的单分散性更差。APEG加入量为0.2g时，开始出现了小的粒子，但是其数目不太多；而随着APEG加入量的增加，出现了越来越多的小粒子。出现这种现象的原因可能与APEG自身聚合到一定分子量也能起到稳定剂的作用，干扰了PVP的稳定剂作用有关。其次，可能APEG自身能形成微球，所以APEG加入量越大，小颗粒就越多。此外，APEG加入量越大，对初始反应体系的极性改变就越大，导致粒径分布更宽。类似的结果也见诸报道[301]。Fig.5-3则说明随着APEG加入量的增加，微球的粒径开始增加，在0.8gAPEG的加入量时达到最大，为4.85μm。而粒径分布数据说明，大部分的情况下，其粒径分布测试数据都小于0.3，只有加入APEG的量为0.8g时，其粒径分布为0.41。根据Fig.5-2和Fig.5-3综合考虑，APEG加入量最佳为0.4g，此时制备的微球单分散性较好。对比两种方法测定的粒径和粒径分布，可知两种方法测定的结果出现了一定程度的偏差。DLS测定的粒径分布明显好于SEM测定的情况，而且DLS测定的粒径也要大于SEM测定的粒径。这是因为DLS测定的是粒子在溶液中的状态，而SEM测定时粒子是干燥的状态。在溶液中，微球表面的一些分子链会呈现伸展状态，而且微球会呈现溶胀，所以测出的粒径会相对偏大一些。另外，在溶液中，粒子会出现团聚，特别是小粒子会吸附或沉积在大的粒子上，所以DLS测定的粒径也会偏大。此外，在大粒子的作用下，DLS可能也难以测定出小的粒子。这也是DLS测定的粒径分布比SEM表现出的粒径分布要好一些，同时也会出现偏离真实的粒径分布。Fig.5-2theSEMofAPEGfunctionalmicrospheres:theamountofAPEGinpolymerizationisfrom0.2,0.4,0.6,0.8,1.2to1.6forAPEG-1,APEG-2,APEG-3,APEG-4,APEG-5andAPEG-6,respectively.0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.812345APEG(g)size(m)0.10.20.30.4SizedistributionFig.5-3theeffectofaddedAPEGamountontheaverageparticlesizeandthesizedistribution.5.3.1.2分级离心在上节中我们发现，采用分散聚合法制备APEG与苯乙烯共聚微球时，得到的粒子单分散性很差，并且出现了很多颗粒很小的粒子。为了分离这些颗粒不均一的粒子，我们试图采用分级离心的方法对制备的微球进行分离。在苯乙烯聚合不同时间（1h、2h、3h、4h和6h）后，再加入0.4gAPEG功能材料，制备了一系列的微球。对制备的微球，先在1800rpm条件下离心10分钟，收集上层悬浮液；再以3800rpm离心10分钟，分别测定离心后的微球的粒径及粒径分布。Fig.5-4就是采用分级离心后的测试结果。从Fig.5-4中可知，在苯乙烯聚合不同的时间后再加入APEG，用1800rpm速度进行离心，得到的粒子粒径逐渐减少，且粒径基本在3-4μm之间。对于3800rpm速度离心的粒子粒径则没有规律。两种离心速度离心的微球，其粒径分布的数值基本在0.3以下，这似乎表面分级离心可以提高制备微球的单分散性。然而，制备微球的SEM照片说明并未得到单分散性很好的粒子(图片并未给出)。其原因可能与微球容易粘附，易团聚，难以有效分离有关。Fig.5-4TherelationshipofAPEGaddedtimeduringpolymerizationandthesizeandsizadistributionofobtainedmicrospheres,withcentrifugationspeedsof1800rpm(a)and3800rpm(b)，respectively.Noted:APEGwasaddedafterpost-polymerizationinvariedtime.5.3.1.3水/乙醇分散介质的极性是影响功能微球粒径及粒径分布的主要因素之一，因为它会影响到微球初始成核的临界链长[117]。苯乙烯的分散聚合多在无水乙醇中进行，但是APEG不溶于无水乙醇，溶于水中，所以在分散聚合时，以水/乙醇为分散介质。我们可以采用溶解度参数（γ）表征分散介质的极性。对于聚苯乙烯（非晶