第八章_园艺植物基因的分离与克隆

第八章园艺植物基因的分离与克隆李英(南京农业大学园艺学院)Tel:[phone]生科楼B6018E-mail:[e-mail]1505052915920130416第八章园艺植物基因的分离与克隆第一节文库筛选法第二节图位克隆技术第三节转座子标签法第四节基因差异表达技术第五节同源序列法第六节基因芯片技术第一节文库筛选法一、园艺植物基因组文库的构建二、园艺植物cDNA文库的构建三、目的基因的筛选一、园艺植物基因组文库的构建⑴基因文库的定义一组DNA或cDNA序列克隆的集合体。⑵基因文库的类型基因组文库：来自园艺植物基因组全部DNA片段组成的基因文库，反映基因组的全部遗传信息。cDNA文库：将某一特定组织表达的mRNA反转录成cDNA组成的基因文库，每个克隆只含1种mRNA信息，足够数目克隆则包含细胞全部mRNA信息。cDNA便于克隆和大量扩增，不像基因组DNA含有内含子很难表达。一、园艺植物基因组文库的构建构建的植物基因组文库需满足的条件文库能够覆盖整个基因组。插入的DNA片断比较大。文库易于保存且较稳定。基因组文库构建流程示意图一、园艺植物基因组文库的构建1.载体的制备1.1完整的基因组文库所需要筛选的重组子数目N＝ln(1-P)/ln(1-f)。N，重组子的数量；P，所要求的概率；f，某一插入片段与相应生物基因组大小的比值。要以0.99的概率获得番茄基因组（9.5×108bp）20kb的插入片段，所需要筛选的重组子数目为：N＝ln(1-0.99)/ln[1-(2×104/9.5×108)]=2.2×1051.2载体的选择：a）质粒载体可承载15kbDNA左右片段(有效的范围为10kb)b）载体可承载25kbDNA左右片段(有效的范围为15kb)c）Cosmid载体可承载45kbDNA左右片段(有效的范围为40kb)1.3载体制备要求：纯度高、去磷酸效果好。去磷酸化是为了提高载体和目标片断的连接效率。纯度如果不高则会在重组克隆中含有大量的细菌基因组DNA，影响文库的质量。一、园艺植物基因组文库的构建要求：一般提取的DNA相对分子量至少应该是文库最终平均插入片断长度的3-5倍。如插入片断达到100kb以上，则要求提取的基因组DNA分子量要达到500kb以上。实践证明：提取的基因组DNA分子量越大，得到的重组克隆的插入片断越大。2.大片段基因组DNA的制备基因组DNA的不完全酶切2.1根据实验需要选择合适的限制性内切酶a)四个识别位点的限制酶出现的几率:1/256b)六个识别位点的限制酶出现的几率:1/40962.2分离目的酶切片段大小的确定a)克隆单个基因：10kbb)克隆基因族：20kb2.3DNA不完全酶切条件的确定a)确定限制酶用量，改变酶切时间b)固定酶切时间，改变限制酶的用量DNA的不完全酶切相同时间不同量3.大片段DNA与克隆载体连接3.1酶切片段的分离与纯化１）低熔点琼脂糖回收目的片段２）试剂盒回收目的片段10kb3.2酶切片段与克隆载体连接连接体系中的四种连接方式：载体自连、载体和基因组DNA片断的连接、基因组DNA片断的自连和基因组片断之间的连接。只有基因组DNA和载体之间的连接才是所需要的。如何提高它们之间的连接效率是连接反应的关键。可以通过调整载体与基因组DNA的比例来达到较好的效果。一般比例为1:5~1:15.基因组DNA片段3’凹端的不完全补平的策略-GATC--CTAG--GATC--CTAG-Sau3AI-GAGATC--CTAGAG-KlenowdATP/dGTP-CTCGAG--GAGCTC-XhoIKlenowdCTP/dTTP-CTCTCGAG--GAGCTCTC-互补GEM-11基因组DNAVector4.载体的遗传转化电转化是转化大肠杆菌使用最普通的一种手段。插入片段越大，转化效率越低。5.克隆的挑取、验证从文库中随机挑选一定量的克隆，摇菌，提取质粒DNA，酶切后，脉冲电泳检查插入片段的大小，并根据数目计算空载率。细胞器DNA的污染会降低文库的实际容载量，一般用线粒体和叶绿体的探针对文库进行检测。6.文库的扩增、分装及保存1)影印滤膜保存法2）文库在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70oC储存（加终浓度为25%的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。3)保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70oC或-25oC下保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都只有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。二、园艺植物cDNA文库的构建二、园艺植物cDNA文库的构建（一）普通cDNA文库的构建1.纯化mRNA样品的制备选择特定发育阶段的特定组织为分离mRNA的材料。mRNA的纯化:利用mRNA的3’末端的poly(A)尾巴与oligo(dT)互补杂交，使mRNA固定在固相介质上，再将mRNA洗脱下来，制备出纯化的mRNA样品。mRNA样品完整性的检测：根据28S和18SrRNA电泳条带的亮度判断RNA的完整性，从而间接地判断mRNA的完整性。如果28SrRNA条带的亮度是18S的两倍，RNA样品完整；如果两条带的亮度反过来，说明RNA样品部分降解；如果无清晰的条带，说明RNA样品已经严重降解。2.cDNA第一链的合成关键是获得大量完整的cDNA拷贝。影响因素：模板mRNA的质量、反转录酶、引物。反转录酶：禽源(AMV)和鼠源反转录酶(M-MuLV)。AMV：除具有DNA聚合酶活性外，还有很强的RNaseH酶活性。M-MuLV：RNaseH活性比AMV低，但反转录效率比AMV低。Superscript反转录酶：除去了MMLV的RNaseH活性，更能保证cDNA第一链的全长和高产。引物常用oligo(dT)和随机六聚体核苷酸。mRNAcDNA第一链的合成5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPs3.1自身引导法合成cDNA第二链的技术流程3.双链cDNA的合成3.2置换合成法利用RNaseH将杂交双链中的mRNA降解，形成多段仍与cDNA第一链保持杂交的RNA片段。利用这些RNA片段作为引物，引导合成第二链cDNA。随着合成产物的延伸，除5’末端的RNA引物外，所有作为引物的RNA片段均被新合成的互补链所置换。通过DNA连接酶作用，将各段互补链连接成完整DNA链。除去残存的5’末端RNA片段，并用T4DNA聚合酶削平3’端突出的单链cDNA，得到一个双链形式的cDNA片段。该方法直接利用第一链反应产物，避免了中间处理和纯化过程造成的cDNA损失，是目前合成cDNA第二链的常用方法。置换合成法合成cDNA第二链的技术流程3.3同聚物引导法在第一链的3′端用末端转移酶加上一段同聚体dG。以oligo(dC)为引物合成第二链。该法最大的缺点是获得的cDNA5’端上游有一段dG:dC残基，可能会抑制表达过程中DNA的转录。但该法在最佳条件下可高效克隆mRNA的5’端序列。cDNA第二链的合成dCTPTdT引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5GGAAAAAOH3’TTTTTp5’3‘HO5‘ppp’5GGAAAAACCCCCCCOH3’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGG3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGGAAAAAOH3’NaOH退火KlenowdNTPs4.双链cDNA的克隆①cDNA的修饰为了提高双链cDNA片段与载体的连接效率，需要对cDNA进行修饰，即给平端的双链cDNA片段添加衔接头。所谓衔接头是人工合成的含有限制酶酶切位点的短双链DNA片段，或者一端为限制酶粘性末端的双链DNA片段。用前一种衔接头连接后，为了避免限制酶对cDNA片段内部可能出现的酶切位点的切割，在添加衔接头之前，文库cDNA需经甲基化酶处理。添加后一类型的衔接头时，不必对文库cDNA进行修饰。合成接头和衔接头cDNA合成接头(含酶切位点)酶切NotI,SalI与载体连接Optional:methylation•接头中含稀有位点，如NotI,SalI(100kb一次)•先甲基化dscDNA，再连接接头4.双链cDNA的克隆②cDNA的克隆将制备的cDNA成功克隆到载体中去的关键问题是cDNA和载体的比例。必须寻找一个适当的比例以避免单个重组体中含有多个串联cDNA分子或产生过高的非重组背景。为提高连接反应效率，可在连接混合物中加适量PEG8000。建成的cDNA文库一般应进行效价测定并扩增，以利多次筛选并长期保存。cDNA文库构建流程示意图5.普通cDNA文库存在的主要不足低丰度表达序列在文库中出现的几率很低，要想得到低丰度表达基因，至少要筛选106个克隆。构建普通cDNA文库所需的mRNA量比较大，达到数微克。筛选普通cDNA文库的工作复杂，需要很长时间，限制了基因克隆的速度。二、园艺植物cDNA文库的构建（二）新型cDNA文库的构建1.PCR介导的cDNA文库原理：以cDNA第一链为模板，设计一组引物，通过PCR扩增获得多拷贝双链cDNA。优点：增加低丰度mRNA的克隆机会；利用仅有的几个细胞或微量的mRNA建立较大的cDNA文库。缺点：PCR合成的片段一般较短，大片段的全长扩增困难；扩增过程中错误掺入率甚高；由于PCR对短片段的扩增效率高于长片段，故mRNA的原始丰度难以在文库中体现。应用：适合于克隆来源困难的组织或细胞的基因。（二）新型cDNA文库的构建2.标准化cDNA文库定义：某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且含量相等的cDNA文库。优点：增加了克隆丰度极低的mRNA的机会。能发现普通cDNA探针所不能发现的稀有转录区。能估计大多数基因的表达水平，并发现组织特异性基因。（二）新型cDNA文库的构建3.染色体或区域特异性cDNA文库用某一染色体或基因组区DNA与合成的cDNA池或已构建的cDNA文库杂交，将捕获的cDNA进行PCR扩增，便可构建染色体或区域特异性cDNA文库。其中的cDNA或定位于该染色体上或与之有同源性。染色体显微切割技术的发展使得构建的文库更狭窄，更具特异性。（二）新型cDNA文库的构建4.消减cDNA文库又称差示文库，常用于克隆不同组织或同一组织在不同的生理状态下表达有差异的基因。在一定条件下用过量不含目的基因的驱动方(driver)与含有目的基因的试验方(tester)进行杂交，选择性地去除相同基因杂交形成的复合物，将含有目的基因的未杂交部分收集后构建相应的文库。由于消减cDNA文库的富集作用，使所需筛选的克隆数减少几十到上百倍。基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较三、目的基因的筛选1.根据目的基因的核苷酸序列筛选根据基因序列设计引物，以基因组DNA或mRNA反转录的cDNA为模板进行P