第八章植物细胞培养及次生物质生产.

植物细胞培养是指在离体条件下，将愈伤组织或其它易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养增殖，获得大量细胞的一种技术。细胞培养与组织培养的区别•1979年国际组织培养协会专业术语委员会建议：–组织培养：从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织。–细胞培养：动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。细胞培养培养类型•根据培养规模：小规模和大批量培养•根据培养方式：悬浮、平板、看护培养•根据要求产物：用于诱变和生产次生(级)产物(Secondaryproducts)的细胞培养悬浮培养单细胞培养细胞规模化培养培养细胞的次级代谢及产物积累悬浮培养（Suspensionculture）•悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。•特点1.培养细胞可不断增殖，且生长速度快。2.液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换，细胞状态可以相对保持一致。细胞悬浮培养的应用SuspensioncellsPlantsArtificialseedsIsolationprotoplastsMutationselectSecondaryproducts细胞悬浮培养的建立愈伤组织的诱导悬浮系的建立与继代培养悬浮细胞的生长动态悬浮细胞同步化愈伤组织的诱导•选择适宜的外植体：–幼胚–下胚轴–子叶•选择适宜的培养基：MS，B5，N6–较高激素浓度–必要的附加物质•要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎适宜悬浮培养适宜再生植株悬浮系的建立与培养callus150~250mlflaskcentrifugeisolationsubculture1g/10mlmedium100~120rmpculturetransfer1time/3d80rpm成功的悬浮细胞培养体系特征•悬浮培养分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下。•均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。•细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天便可增加一倍。悬浮细胞的生长动态悬浮细胞生长的衡量•根据不同培养时间的细胞数变化，或细胞质量变化。•生长速率(p)：不同时间细胞密度(x)的自然对数与起始密度(x0)的自然对数之差与培养时间(t)的比值p＝(lnx-lnx0)/t•鲜重：真空减压过滤后称重，反应细胞生长情况•干重：鲜细胞烘干至衡重，反应细胞质量影响悬浮细胞生长的因素•起始愈伤组织的质量•接种细胞密度：悬浮细胞的起始密度一般在0.5~2.5×105个细胞/毫升。接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长。–最低有效密度：即能使细胞分裂、增殖的最低接种量。•培养条件：培养基、方式、温度、继代周期。影响悬浮细胞生长的因素•培养基–应用条件培养基（生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基）提供单细胞生长和分裂所需的特殊代谢物。–基本培养基成分的调节视不同的培养目的而定培养基设计时，一般均以诱导愈伤组织形成的培养基为基础进行调整。常用的培养基有MS、B5、LS、N6等。–植物激素和其他附加成分的应用。影响悬浮细胞生长的因素•培养方式：摇瓶，反应器（气动式、搅拌式）；分批培养，半连续培养和连续培养•温度25℃•继代周期–指具有一定起始密度的细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增长停止的一个过程。–培养周期的长短是由起始细胞密度、延迟期的长短、生长速率等决定。–继代培养（Subculture）：继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。悬浮培养细胞的同步化•细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。•植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化是十分困难的。•同一培养体系的植物细胞经常不能处于同一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、代谢以及生理生化状态等复杂化。•通过一定的理化措施可以使同一体系中的细胞达到相对同步化。什么措施？细胞周期饥饿法•饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂不能进行，即不能进入M期。因此，通过饥饿法可以获得处于G1和G2期的同步化细胞。–氮饥饿时，通常获得G1期的同步化细胞–磷和碳饥饿时，获得G1和G2期的同步化细胞。•将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，细胞分裂又可重新恢复。抑制剂法•通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期(G1)的同步化细胞。–常用抑制剂主要有5-氟脱氧尿苷(FudR)和羟基尿(HU)。–用羟基尿处理获得同步化细胞的方法在小麦、玉米、西芹等植物细胞培养中已有成功应用。•利用破坏微管的药物将细胞阻断在中期，常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较小。分选法•依据：细胞体积大小•方法–常规分选方法是梯度离心–精细的分选可采用流式细胞仪•优点–操作简单–分选细胞维持了自然生长状态，不会有其它处理带来的副作用•缺点–分选精细度较差低温处理•可以提高培养体系中细胞同步化的程度–Okamura等曾采用此方法使胡萝卜悬浮细胞较好地同步化。–梅兴国等（2001）采用6℃低温处理红豆杉细胞也获得较明显同步化效果。•可能的原因–不同的温度对细胞的有丝分裂有极明显的影响，在一定范围内，温度下降使细胞分裂速度减慢，细胞周期延长，从而相应地延长了分裂期的时间，使分裂指数提高，细胞同步化率升高。单细胞培养•意义•分离方法•培养方法植物单细胞培养的意义•建立单细胞无性系，有助于研究植物细胞的特性和潜力，了解细胞间的相互关系，研究细胞分化、发育和形态发生的分子机理。•采用生物化学的方法，对培养的单细胞进行人工诱发突变，或建立遗传转化受体。•在细胞水平上对花粉进行培养，可排除体细胞干扰。•利用生物反应器可大规模地培养细胞，进行次生代谢产物的生产。单细胞分离方法•机械法•具体做法：–将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化–从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团•优点：–细胞不受酶伤害；有利于进行细胞的生理和生化研究。单细胞分离方法•酶解法–酶对细胞壁有一定的软化作用，所以采用酶法时，必须加入甘露醇等渗透压保护剂；可通过加入硫酸葡聚糖钾来提高游离细胞的产量。(纤维素酶，果胶酶)•优点–可获得较多的叶肉游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）。细胞悬浮过滤与培养基混合植板培养克隆愈伤组织细胞平板培养(platingculture)•指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创–单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞。–单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×103个/毫升–植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为5mm左右。细胞平板培养（platingculture)•平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。每个平板形成的细胞团数植板率＝每个平板接种的细胞总数细胞平板培养(platingculture)•优点：–单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株筛选和突变体筛选的常用方法。–由于它具有筛选效率高、筛选量大、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。•缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。看护培养（nurseculture）•Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。•优点：简便易行，效果好。•缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。微室培养(microchamberculture)•在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。由Jones等在1960年设计的。•优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程•缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。•细胞起始密度：30～80个/室。双层滤纸植板培养Horsch等（1980）建立培养皿培养基饲养细胞层培养细胞看护滤纸转移滤纸植物细胞规模化培养•意义•规模化培养体系的建立•生物反应器•规模化培养的技术问题意义•应用培养细胞系统合成有用的天然产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。–目前有约25％的法定药品来自植物，其有效成分均为次生产物。–许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品部分代表性植物次生产物及其植物资源工业用途次生产物植物资源医药可待因罂粟薯蓣皂苷配基三角叶薯蓣奎宁金鸡纳树地高辛狭叶毛地黄莨菪胺曼陀罗长春花碱长春花农业化学除虫菊酯除虫菊食品，饮料留兰香薄荷化妆品茉莉油茉莉花植物细胞大规模培养的技术要求•从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。•从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：–培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。–细胞生长速度快，短时间内能生产较多产物–产物不被迅速降解，最好能分泌到培养基中植物细胞规模化培养体系的建立•种子细胞选择–外植体–高产细胞•种子细胞增殖与放大培养•大规模培养体系建立种子细胞选择•外植体选择–植物类型：遗传基础。在确定生产某一种化合物以后，首先必须准确选择那些能够产生目的化合物的植物种类及品种或单株。–组织器官：由于天然产物一般为次生代谢产物，而植物次生代谢产物的积累具有组织器官的特异性，因此，在起始细胞培养时尽量选择自然状态下产生天然产物的器官、组织作为外植体。种子细胞选择•高产细胞系的筛选–悬浮细胞系–单细胞克隆–种细胞增殖种子细胞选择•直选法–李志勇等（2002）直接从起始细胞中挑选不同细胞团建立了10个大蒜细胞悬浮系，比较研究显示，不同悬浮细胞系的SOD合成能力最大差异可达5倍。•适当增加选择压力，采用一些诱变的方法–梅兴国（2001）通过在培养基中添加1.6mM的L-Phe，筛选出了抗Phe的红豆杉细胞悬浮系，其紫杉醇含量高于原型细胞3～5倍。种子细胞增殖与放大培养•目的–准备材料–提供技术参数•过程–摇瓶–反应器大规模培养体系的建立•培养方式–成批培养、半连续培养和连续培养。•培养方式的选择–根据次生产物积累而定，通常还根据不同要求进行改进。–当细胞生长和产物合成需要不同的培养基时，就需要采用两步法培养，先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，将其转至产物合成培养基中培养，在产物合成阶段又可采用连续培养方式以延长细胞生产时间。生物反应器类型及特点•是指用于高等生物细胞批量化培养的装置及其相应控制系统。•适合植物细胞培养的反应器应该具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。•搅拌式•气动式•固定化式•其它—光照生物反应器，转鼓式反应器类型体积（L）培养植物种类搅拌式7，15D.carota胡萝卜搅拌式20，15500N.tabacum烟草搅拌式5000C.roseus长春花螺旋搅拌式20C.blumei五彩苏提升搅拌式2.5P.elliotii湿地松鼓泡式20，30，130P.ginseng人参鼓泡式65，1500N.tabacum烟草外环气升式10，30，85C.roseus长春花导筒气升式20，210D.lanata狭叶毛地黄转鼓式1－4V.rosea长春花植物细胞培养生物反应器搅拌式反应器气动式反应器•又称空气提升式反应器•特点：剪切力小，但搅拌不很均匀。Flash固定化反应器•种类：–包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐和聚丙烯酰胺等–附着式固定化培养系统：支持物多采用尼龙网、聚氨酯泡沫和中空