菠菜中色素的提取分离和鉴定(有机化学实验)

菠菜中的色素提取、分离及鉴定一、实验目的1.进一步熟悉和掌握薄层色谱的原理及应用2.了解菠菜中主要色素的基本性质，通过菠菜色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法及原理3.掌握用紫外光谱和荧光光谱鉴别菠菜中色素的原理及方法二、菠菜中的色素简介菠菜叶中富含多种色素成分,如叶绿素（绿色）、胡萝卜素（橙黄色）和叶黄素（黄色）等多种天然色素。叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H7O6N4Mg)，结构见图1。二者差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但分子中大的烷基结构使它易溶于丙酮,乙醇,乙醚,石油醚等有机溶剂。胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即α-,β-和γ-胡萝卜素，其中β-异构体含量最多，也最重要。在生物体内，β-体受酶催化氧化即形成维生素A。目前β-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与β-胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。根据这些色素在有机溶剂中的溶解性,可将它们提取出来。NNNNH3CCHCH2RCH2CH3CH3H3COCO2CH3CH2CH2OOCH3CH3CH3CH3CH3Mg叶绿素a和叶绿素b的结构（叶绿素a：R=CH3，叶绿素b：R=CHO）H3CCH3RCH3H3CRH3CCH3CH3CH3CH3CH3β-胡萝卜素和叶黄素的结构（β-胡萝卜素:R=H，叶黄素:R=OH）菠菜中各色素的理化性质绿色植物中的叶绿体色素在把光能转变为化学能的光和作用中起着重要作用。叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括β-胡萝卜素，叶黄素，叶绿素a和叶绿素b四种色素，它们在叶绿体中的含量比约为2：1：3：1。叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。(1)叶绿素a有四个甲基与卟吩核连接(R—CH3)。蜡状蓝黑色微小晶体。熔点117～120℃。溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿、二硫化碳和苯,不溶于石油醚。其乙醇溶液是蓝绿色，并有深红色荧光。(2)叶绿素b有三个甲基和一个醛基与卟吩核连接(R=—CHO)。蜡状蓝黑色微小晶体。熔点120～130℃。溶于乙醇和乙醚，难溶于石油醚。乙醚溶液有亮绿色。其它有机溶剂的溶液通常是绿色至黄绿色，并有红色荧光。可用作肥皂、脂肪、油蜡、食品、化妆品和医药用的无毒着色剂。由绿叶用乙醇萃取而制得,也可用化学方法合成。(3)胡萝卜素胡萝卜素有多种异构体,是四萜类化合物。α-胡萝卜素为红色结晶。熔点187℃。旋光度+385°(c=0.08,苯)。溶于乙醚、苯、氯仿。β-胡萝卜素为红棕色结晶,熔点181℃,溶于乙醚、丙酮、苯、石油醚。γ-胡萝卜素为紫色棱形结晶，熔点177.5℃，溶于苯、氯仿。α-，β-和γ-胡萝卜素常共存于许多植物中，β-胡萝卜素含量最高。β-胡萝卜素在植物中几乎总是和叶绿素共存，含量最多的是胡萝卜、棕榈油以及多种绿叶植物。用做食物色素、保健食品，以及作防晒化妆品成分，还可用作制造维生素A的原料。(4)叶黄素又称胡萝卜醇(carotenol)。一类羟基类胡萝卜素的衍生物。以乙醚加甲醇精制，得黄色穗状物。具金属光泽的结晶。熔点183℃。不溶于水。溶于油性溶剂。光稳定性较好。主要与叶绿素、胡萝卜素共存于绿色植物的叶和花中。在天然黄色素中，它的价格较贵，可用于食品着色。也有添加于禽饲料中，使禽蛋蛋黄增进黄色。三.实验原理色谱法是一种物理的分离方法，其原理是利用混合物中各成分的物理化学性质的差异，当选择某一条件使混合物中各成分流过支持剂或吸附剂时，各成分可因其物理性质不同而分离。分离效果的好坏关键在于条件的选择。薄层色谱是在玻片上涂布固体吸附剂，利用样品对固体吸附剂的吸附能力不同，选择对样品溶解（解附）能力不同的溶剂，将混合物各成分按照极性大小不同随溶剂前进速度不同而分开的方法。应用：薄层色谱可以用来分离、鉴别化合物，也可以用于跟踪反应进程。Rf值与分子结构的关系Rf=溶剂移动的距离溶质移动的距离Rf值越大，样品与固体吸附剂吸附越紧，即样品与固体吸附剂分子间作用力越大，说明样品极性越强或分子量越大。本实验利用有机溶剂将菠菜中的色素浸提出来，利用柱层析和薄层层析法将色素分离开来，根据各色素的颜色、分子极性与Rf值的关系、吸收光谱、荧光对分离出的色素进行鉴定归属，讨论结构对Rf值、吸收光谱的影响。四.仪器试剂新鲜菠菜、石油醚、乙醇、丁醇、中性氧化铝（柱层析用）、薄层层析硅胶、丙酮、苯、饱和食盐水、无水硫酸钠、羧甲基纤维素钠（CMC）、载玻片、研钵、层析缸、点样毛细管、层析柱、滴管、分液漏斗、烘箱、紫外分光光度计、荧光仪。五、实验方法1薄层板的制备称取适量硅胶G，按硅胶和水1∶3(w/w)的比例加入0.5%CMC水溶液，调成糊状，用倾泻法涂在干净薄层板上，轻轻振摇，使硅胶浆料均匀平整铺开，放置~1h,晾干，置于烘箱中，逐渐升温至110℃活化0.5h,冷却，置于干燥器中备用。2样品制备称取5克洗净晾干水分的新鲜的菠菜叶，用剪刀剪碎，放在锥形瓶中，加入30mL2﹕1（v/v）的石油醚和乙醇混合溶剂，浸没菠菜叶片，用玻棒搅动数分钟，以利于菠菜叶的细胞破裂，色素浸出。布氏漏斗抽滤，将菠菜汁转入分液漏斗，分去水层，分别用等体积的饱和食盐水和蒸馏水洗涤两次，以除去萃取液中的乙醇（洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化）。弃去水-乙醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥后滤入锥型瓶，置于暗处备用。3薄层层析用吸管吸取菠菜萃取液，小心慢慢滴在制铺好的薄层板上，滴入在硅胶板上的萃取液要成一条直线，直线离板下沿约1.5~2厘米，晾干。放入装有2﹕1.5﹕2的石油醚-丙酮-苯（v/v）混合展开剂的层析缸内，于暗处室温展开，得五条色带。取出，待溶液挥发后，测量各色带及溶剂前沿到原点的距离，计算Rf值。尝试不同展开剂：石油醚-丙酮=8:2（v/v）、石油醚-乙酸乙酯=6:4（v/v）进行薄层层析，比较溶剂对展开效果的影响。4、光谱检测将各条色带用紫外扫描仪在350～750nm范围内扫描，记录各条色带紫外-可见光谱、并观测测各色带的荧光。六、结果与讨论填写表1，并根据各色素的颜色、分子极性与Rf值的关系、吸收光谱、荧光对分离出的色素进行鉴定归属，讨论结构对Rf值、吸收光谱的影响。表1菠菜叶片色素色谱分析数据及归属编号颜色Rf值荧光紫外吸收（nm）(丙酮)文献值[6，7]归属12345七.思考题1.为什么可以用Rf值来鉴定化合物？2.在混合物的薄层色谱中，如何判定各组分在薄板上的位置？比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素三种色素的极性，为什么胡萝卜素在层析柱中移动最快？3.展开剂的高度若超过点样线，对薄层色谱结果有何影响？