虎奶菇抑菌物质与食品防腐剂抑菌活性的比较

虎奶菇抑菌物质与食品防腐剂抑菌活性的比较林陈强，蔡海松，林戎斌，郑永标，林新坚，陈济琛*（福建省农业科学院土壤肥料研究所，福建福州350013）摘要：本文比较了虎奶菇发酵液乙酸乙脂提取物与苯甲酸、山梨酸、苯甲酸钠，山梨酸钾，Nisin、Natamycin的抑菌能力。结果表明虎奶菇发酵液的乙酸乙酯提取物对几种细菌指示菌均有较好抑制作用，对金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，蜡样芽孢杆菌，肠炎沙门氏菌的抑制效果与其他防腐剂相比都达到差异极显著水平；对黄曲霉，黑曲霉的抑制效果较差；对白色链珠菌，啤酒酵母的抑制作用仅次于Natamycin。萃取物对金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌，大肠杆菌，肠炎沙门氏菌,绿浓杆菌的最小抑菌浓度分别为1.25mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL。关键词：液体发酵，乙酸乙酯提取物，MIC虎奶菇是一种产于亚洲热带地区珍稀药用菌，中国主要分布在云南省的腾冲﹑章凤等地。菌物学家鉴定，虎奶菇隶属担子菌亚门﹑层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属（平菇属），学名为Pleurotustuber-regium（Fr.）Sing[1]。虎奶菇菌丝[2]及液体发酵后发酵液[3]具有抑菌活性，特别是是对一些革兰氏阳性菌具有较强的抑制作用；苯甲酸，山梨酸，苯甲酸钠，山梨酸钾，Nisin，Natamycin都是目前比较常用的食品防腐剂，它们抑菌谱较广，对多数腐败菌有抑制作用。我们用平板打孔法比较虎奶菇发酵液乙酸乙脂提取物与苯甲酸、山梨酸、苯甲酸钠，山梨酸钾，Nisin，Natamycin的抑菌能力。1材料与方法1.1菌种1.1.1虎奶菇(Pleurotustuber-regium),引自福建三明真菌研究所1.1.2指示菌细菌：金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus，枯草芽孢杆菌Bacillussubilis，大肠杆菌Escherichiacoli，蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus，肠炎沙门氏菌Salmonellaenteritidis，绿浓杆菌P.aeruginosa。酵母菌：白色念珠菌Candidaalbicans，啤酒酵母Saccharomycescerevisiae。霉菌：黑曲霉Aspergillusniger，黄曲霉Aspergilusflavus。以上菌种由福建省疾病预防控制中心和福建师范大学提供。1.2培养基1.2.1液体菌种培养基：黄豆粉10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH自然。1.2.2液体发酵培养基：黄豆粉15g，甘露醇25g，蒸馏水1000mL。1.2.3PDA斜面培养基：马铃薯20g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。1.2.4牛肉膏-蛋白胨斜面培养基：牛肉膏5g，NaCl5g，蛋白胨10g，蒸馏水1000mL，pH7.2。1.2.5水琼脂培养基:琼脂20g，蒸馏水1000mL。1.3实验方法1.3.1虎奶菇液体菌种制备：250mL三角瓶装100mL液体菌种培养基，接斜面菌种（1cm×1cm）两块，160r/min摇床30℃培养7d。无菌条件下取菌球，研钵磨碎，加入60mL无菌基金项目：福建省自然科学基金项目“虎奶菇抑菌活性物质的研究”（B0310024）。作者简介：林陈强（1979－），男，2002年毕业于中国农业大学食品学院，实研，主要从事食用菌活性成分研究*通讯作者：Tel：[phone]E—mail：[e-mail]水震荡均匀，制成液体菌种。1.3.2指示菌菌悬液制备：取各种指示菌2环接至45mL无菌水中振荡均匀备用。1.3.3虎奶菇发酵液制备[3][4]液体发酵营养成分为黄豆粉含量15g/L、甘露醇含量25g/L；起始PH自然，250mL三角瓶每瓶装80mL，121℃灭菌20min；接入液体菌种（V:V＝1:100），160r/min摇床30℃培养6d，发酵液过60目筛，5000g/min离心取上清液备用。1.3.4样品制备1.3.4.1发酵液乙酸乙脂提取物：发酵液65℃真空浓缩，5000g/min离心取上清液，用乙酸乙脂反复萃取，酯相减压浓缩至恒重作为提取物Ⅰ，用25％甲醇稀释为5mg/mL；空白液体培养基用乙酸乙酯反复萃取，酯相减压浓缩至恒重，作为提取物Ⅱ，用25％甲醇稀释为5mg/mL。以25％甲醇溶液为空白对照（CK）。1.3.4.2苯甲酸、山梨酸、苯甲酸钠、山梨酸钾、Nisin、Natamycin用25％甲醇分别稀释浓度为5mg/mL，苯甲酸钠、山梨酸钾溶液调节pH为4－5。1.3.5抑菌活性的测定水琼脂培养基溶化倒入15cm培养皿，每皿120mL。凝固后倒入50mL牛肉膏-蛋白胨培养基覆盖（霉菌及酵母指示菌倒入50mLPDA培养基覆盖），凝固后吸0.4mL指示菌液均匀涂布于培养基表面。打孔（d=0.9cm），加入待测样品0.6mL，样品浓度为5mg/mL，细菌37℃恒温培养24h，霉菌及酵母26℃培养48h。试验6次重复，取抑菌圈直径的平均值，比较抑菌活性。1.3.6发酵液乙酸乙脂提取物对几种指示菌的最小抑菌浓度（MIC），取一列洁净无菌的小试管，分别加牛肉膏-蛋白胨液体培养基4mL，第一管加入含20mg/mL的发酵液乙酸乙脂提取物甲醇溶液4mL，后倍比稀释至次末管后吸出4mL弃去，各管分别加入106cuf/mL指示菌菌悬液0.4mL，摇匀，置37℃培养箱中培养24h，观察结果。2结果与分析2.1抑菌物质的抑菌能力差异2.1.1以金黄色葡萄球菌为指示菌测定各个抑菌物质抑菌能力差异结果如表1表1以金黄色葡萄球菌为指示菌不同抑菌物质抑菌能力Table1Theantimicrobialabilityofdifferentantimicrobialsubstance抑菌物质antimicrobialsubstance抑菌圈直径Diameterofinhibitionzone(mm)差异显著性Significancelevel0.050.01CK0dDⅡ0dDⅠ51.5±1.25aAnisin25.5±0.48bB苯甲酸23.1±0.47bB山梨酸13.3±2.10cC苯甲酸钠0dD山梨酸钾0dD数据为4次重复的平均值，CK：25％甲醇Valuesaremeansof4replicates±s.d，CK：25％methanol2.1.2以为枯草芽孢杆菌指示菌测定各个抑菌物质抑菌能力差异结果如表2表2以枯草芽孢杆菌为指示菌不同抑菌物质抑菌能力Table2Theantimicrobialabilityofdifferentantimicrobialsubstance抑菌物质antimicrobialsubstance抑菌圈直径Diameterofinhibitionzone(mm)差异显著性Significancelevel0.050.01CK0fDⅡ0fDⅠ39.4±0.84aAnisin24.2±0.80bB苯甲酸22.2±0.76cB山梨酸15.6±0.58dC苯甲酸钠0fD山梨酸钾13.5±0.21eC数据为4次重复的平均值,CK：25％甲醇Valuesaremeansof4replicates±s.d,CK：25％methanol2.1.3以蜡样芽孢杆菌为指示菌测定各个抑菌物质抑菌能力差异结果如表3表3以蜡样芽孢杆菌为指示菌不同抑菌物质抑菌能力Table3Theantimicrobialabilityofdifferentantimicrobialsubstance抑菌物质antimicrobialsubstance抑菌圈直径Diameterofinhibitionzone(mm)差异显著性Significancelevel0.050.01CK0eEⅡ0eEⅠ39.4±1.31aAnisin18.7±0.45cC苯甲酸25.4±1.45bB山梨酸19.2±1.82cC苯甲酸钠12.8±1.06dD山梨酸钾15.9±1.31cdCD数据为4次重复的平均值,CK：25％甲醇Valuesaremeansof4replicates±s.d.CK：25％methanol2.1.4以大肠杆菌为指示菌测定各个抑菌物质抑菌能力差异结果如表4表4以大肠杆菌为指示菌不同抑菌物质抑菌能力Table4Theantimicrobialabilityofdifferentantimicrobialsubstance抑菌物质antimicrobialsubstance抑菌圈直径Diameterofinhibitionzone(mm)差异显著性Significancelevel0.050.01CK0dDⅡ0dDⅠ37.9±1.56aAnisin11.8±1.08cC苯甲酸18.8±2.04bB山梨酸13.6±1.37cC苯甲酸钠0dD山梨酸钾0dD数据为4次重复的平均值,CK：25％甲醇Valuesaremeansof4replicates±s.d.CK：25％methanol2.1.5以肠炎沙门氏菌为指示菌测定各个抑菌物质抑菌能力差异结果如表5表5以肠炎沙门氏菌为指示菌不同抑菌物质抑菌能力Table5Theantimicrobialabilityofdifferentantimicrobialsubstance抑菌物质antimicrobialsubstance抑菌圈直径Diameterofinhibitionzone(mm)差异显著性Significancelevel0.050.01CK0dDⅡ0dDⅠ36.9±0.85aAnisin11.5±1.50cC苯甲酸22.4±2.26bB山梨酸15.2±2.25cC苯甲酸钠0dD山梨酸钾0dD数据为4次重复的平均值,CK：25％甲醇Valuesaremeansof4replicates±s.d.CK：25％methanol2.1.6以绿浓杆菌为指示菌测定各个抑菌物质抑菌能力差异结果如表6表6以绿浓杆菌为指示菌不同抑菌物质抑菌能力Table6Theantimicrobialabilityofdifferentantimicrobialsubstance抑菌物质antimicrobialsubstance抑菌圈直径Diameterofinhibitionzone(mm)差异显著性Significancelevel0.050.01CK0eDⅡ0eDⅠ14.5±0.74bBnisin0eD苯甲酸17.6±1.15aA山梨酸13.1±0.49cB苯甲酸钠0eD山梨酸钾11.0±1.14dC数据为4次重复的平均值,CK：25％甲醇Valuesaremeansof4replicates±s.d.CK：25％methanol从表1-6可以看出,虎奶菇发酵液乙酸乙脂萃取物对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、腊样芽孢杆菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌的抑菌能力显著高于其他几种抑菌物质，差异极显著。其中对金色葡萄球菌的抑制效果是nisin和苯甲酸的2倍；对绿浓杆菌的抑制效果较差，弱于苯甲酸，差异极显著，但优于山梨酸还山梨酸钾，差异极显著。2.1.7以黄曲霉为指示菌测定各个抑菌物质抑菌能力差异结果如表7表7以黄曲霉为指示菌不同抑菌物质抑菌能力Table7Theantimicrobialabilityofdifferentantimicrobialsubstance抑菌物质antimicrobialsubstance抑菌圈直径Diameterofinhibitionzone(mm)差异显著性Significancelevel0.050.01CK0eDⅡ0eDⅠ19.9±0.38cBCNatamycin34.7±0.99aA苯甲酸20.3±1.03bcB山梨酸22.5±1.25bB苯甲酸钠0eD山梨酸钾17.0±0.45dC数据为4次重复的平均值,CK：25％甲醇Valuesaremeansof4replicates±s.d.CK：25％methanol2.1.8以黑曲霉为指示菌测定各个抑菌物质抑菌能力差异结果如表8表8以黑曲霉为指示菌不同抑菌物质抑菌